Metaboliti za kinga mwilini ni sifa muhimu ya mazingira madogo ya uvimbe (TME), lakini isipokuwa chache, utambulisho wao bado haujulikani sana. Hapa, tulichambua uvimbe na seli T kutoka kwa uvimbe na ascites za wagonjwa walio na saratani ya serous ya kiwango cha juu (HGSC) ili kufichua metabolome ya sehemu hizi tofauti za TME. Ascites na seli za uvimbe zina tofauti kubwa za kimetaboli. Ikilinganishwa na ascites, seli T zinazoingia kwenye uvimbe zimetajiriwa kwa kiasi kikubwa katika 1-methylnicotinamide (MNA). Ingawa kiwango cha MNA katika seli T kimeinuliwa, usemi wa nikotinamide N-methyltransferase (kimeng'enya kinachochochea uhamishaji wa vikundi vya methyl kutoka S-adenosylmethionine hadi nicotinamide) ni mdogo kwa fibroblasts na seli za uvimbe. Kiutendaji, MNA hushawishi seli T kutoa alpha ya sababu ya necrosis ya cytokine inayokuza uvimbe. Kwa hivyo, MNA inayotokana na TME huchangia udhibiti wa kinga wa seli T na inawakilisha lengo linalowezekana la tiba ya kinga kwa matibabu ya saratani ya binadamu.
Metaboliti zinazotokana na uvimbe zinaweza kuwa na athari kubwa ya kuzuia kinga dhidi ya uvimbe, na ushahidi zaidi na zaidi unaonyesha kwamba zinaweza pia kutumika kama nguvu muhimu ya kuendesha ugonjwa (1). Mbali na athari ya Warburg, kazi ya hivi karibuni imeanza kuainisha hali ya kimetaboliki ya seli za uvimbe na uhusiano wake na hali ya kinga ya mazingira madogo ya uvimbe (TME). Uchunguzi kuhusu mifano ya panya na seli T za binadamu umeonyesha kuwa kimetaboliki ya glutamine (2), kimetaboliki ya oksidi (3) na kimetaboliki ya glukosi (4) vinaweza kutenda kwa kujitegemea kwenye vikundi vidogo mbalimbali vya seli za kinga. Metaboliti kadhaa katika njia hizi huzuia utendaji kazi wa seli T dhidi ya uvimbe. Imethibitishwa kuwa kizuizi cha kimeng'enya cha coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) kinaweza kuharibu kuenea kwa seli T, na ongezeko la BH4 mwilini linaweza kuongeza mwitikio wa kinga dhidi ya uvimbe unaosababishwa na CD4 na CD8. Kwa kuongezea, athari ya kukandamiza kinga ya kynurenine inaweza kuokolewa kwa kupewa BH4 (5). Katika glioblastoma iliyobadilika ya isocitrate dehydrogenase (IDH), utolewaji wa enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) huzuia uanzishaji, ukuaji na shughuli za saitolisi ya seli T (6). Hivi majuzi, imeonyeshwa kuwa methylglyoxal, bidhaa ya ziada ya glycolysis, huzalishwa na seli za kukandamiza zenye asili ya myeloidi, na uhamishaji wa seli T wa methylglyoxal unaweza kuzuia utendaji kazi wa seli T wenye athari. Katika matibabu, kupunguzwa kwa methylglyoxal kunaweza kushinda shughuli za seli za kukandamiza zinazotokana na myeloidi (MDSC) na kuongeza tiba ya kuzuia alama za ukaguzi kwa njia ya ushirikiano katika mifano ya panya (7). Masomo haya kwa pamoja yanasisitiza jukumu muhimu la metaboliti zinazotokana na TME katika kudhibiti utendaji kazi na shughuli za seli T.
Utendaji kazi mbaya wa seli T umeripotiwa sana katika saratani ya ovari (8). Hii ni kwa kiasi fulani kutokana na sifa za kimetaboliki zilizomo katika upungufu wa oksijeni na mishipa isiyo ya kawaida ya uvimbe (9), ambayo husababisha ubadilishaji wa glukosi na tryptophan kuwa bidhaa ndogo kama vile asidi ya lactic na kynurenine. Lakteti nyingi ya nje ya seli hupunguza uzalishaji wa interferon-γ (IFN-γ) na husababisha utofautishaji wa vikundi vidogo vya kukandamiza myelosuppression (10, 11). Matumizi ya tryptophan huzuia moja kwa moja kuongezeka kwa seli T na kuzuia ishara ya vipokezi vya seli T (12-14). Licha ya uchunguzi huu, kazi nyingi zinazozunguka umetaboli wa kinga zilifanyika katika utamaduni wa seli T ndani ya vitro kwa kutumia vyombo vya habari vilivyoboreshwa, au zimepunguzwa kwa mifano ya panya wa jinsi moja ndani ya mwili, ambayo hakuna inayoonyesha kikamilifu tofauti za saratani za binadamu na mazingira ya kifiziolojia ya macro na micro.
Sifa ya kawaida ya saratani ya ovari ni kuenea kwa peritoneal na kuonekana kwa ascites. Mkusanyiko wa maji ya seli katika ascites unahusishwa na ugonjwa ulioendelea na ubashiri mbaya (15). Kulingana na ripoti, sehemu hii ya kipekee haina oksijeni, ina viwango vya juu vya kipengele cha ukuaji wa endothelial cha mishipa (VEGF) na indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), na huingizwa na seli za udhibiti wa T na seli za kuzuia myeloid (15-18). Mazingira ya kimetaboliki ya ascites yanaweza kuwa tofauti na yale ya uvimbe wenyewe, kwa hivyo upangaji upya wa seli T katika nafasi ya peritoneal haujulikani. Kwa kuongezea, tofauti kuu na tofauti kati ya ascites na metabolites zilizopo katika mazingira ya uvimbe zinaweza kuzuia kupenya kwa seli za kinga na kazi zao kwenye uvimbe, na utafiti zaidi unahitajika.
Ili kutatua matatizo haya, tulibuni mbinu nyeti ya utenganishaji wa seli na spektrografia ya kioevu sanjari ya spektrometri ya wingi (LC-MS/MS) ili kusoma aina tofauti za seli (ikiwa ni pamoja na seli za CD4 + na CD8 + T) pamoja na ndani na kati ya uvimbe. Metaboliti zake huzunguka seli katika mazingira sawa ya ascites na uvimbe ya mgonjwa. Tunatumia njia hii pamoja na saitometri ya mtiririko wa vipimo vya juu na mpangilio wa RNA ya seli moja (scRNA-seq) ili kutoa picha iliyoamuliwa sana ya hali ya kimetaboliki ya makundi haya muhimu. Njia hii ilifunua ongezeko kubwa la kiwango cha 1-methylnicotinamide (MNA) katika seli za T za uvimbe, na majaribio ya ndani ya vitro yalionyesha kuwa athari ya kinga ya mwili ya MNA kwenye utendakazi wa seli T haikuwa inajulikana hapo awali. Kwa ujumla, njia hii inaonyesha mwingiliano wa kimetaboliki kati ya uvimbe na seli za kinga, na hutoa ufahamu wa kipekee kuhusu metaboliti za udhibiti wa kinga, ambazo zinaweza kuwa muhimu kwa matibabu ya tiba ya kinga ya saratani ya ovari inayotegemea seli T. Fursa za matibabu.
Tulitumia saitometri ya mtiririko wa vipimo vya juu ili kupima kwa wakati mmoja ufyonzaji wa glukosi [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) na shughuli za mitochondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ni alama za kawaida zinazotofautisha seli za kinga na idadi ya seli za uvimbe (Jedwali S2 na Mchoro S1A). Uchambuzi huu ulionyesha kuwa ikilinganishwa na seli T, ascites na seli za uvimbe zina viwango vya juu vya ufyonzaji wa glukosi, lakini zina tofauti ndogo katika shughuli za mitochondrial. Ufyonzaji wa wastani wa glukosi wa seli za uvimbe [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ni mara tatu hadi nne zaidi ya seli T, na ufyonzaji wa wastani wa glukosi wa seli CD4 + T ni mara 1.2 zaidi ya seli CD8 + T, ambayo inaonyesha lymphocytes zinazoingia kwenye uvimbe (TIL) zina mahitaji tofauti ya kimetaboliki hata katika TME moja (Mchoro 1A). Kwa upande mwingine, shughuli ya mitochondria katika seli za uvimbe ni sawa na ile ya seli za CD4 + T, na shughuli ya mitochondria ya aina zote mbili za seli ni kubwa kuliko ile ya seli za CD8 + T (Mchoro 1B). Kwa ujumla, matokeo haya yanaonyesha kiwango cha kimetaboliki. Shughuli ya kimetaboliki ya seli za uvimbe ni kubwa kuliko ile ya seli za CD4 + T, na shughuli ya kimetaboliki ya seli za CD4 + T ni kubwa kuliko ile ya seli za CD8 + T. Licha ya athari hizi katika aina za seli, hakuna tofauti thabiti katika hali ya kimetaboliki ya seli za CD4 + na CD8 + T au uwiano wao katika ascites ikilinganishwa na uvimbe (Mchoro 1C). Kwa upande mwingine, katika sehemu ya seli za CD45, uwiano wa seli za EpCAM+ katika uvimbe uliongezeka ikilinganishwa na ascites (Mchoro 1D). Pia tuliona tofauti dhahiri ya kimetaboliki kati ya vipengele vya seli za EpCAM+ na EpCAM. Seli za EpCAM+ (tumor) zina ufyonzaji mkubwa wa glukosi na shughuli za mitochondria kuliko seli za EpCAM, ambayo ni kubwa zaidi kuliko shughuli ya kimetaboliki ya fibroblasts katika seli za uvimbe katika TME (Mchoro 1, E na F).
(A na B) Kiwango cha wastani cha mwangaza (MFI) cha ufyonzaji wa glukosi (2-NBDG) (A) na shughuli za mitochondria za seli za CD4 + T (MitoTracker nyekundu iliyokolea) (B) Grafu wakilishi (kushoto) na data iliyoorodheshwa (Kulia), seli za CD8 + T na seli za uvimbe za EpCAM + CD45 kutoka kwa ascites na uvimbe. (C) Uwiano wa seli za CD4 + na CD8 + (za seli za CD3 + T) katika ascites na uvimbe. (D) Uwiano wa seli za uvimbe za EpCAM + katika ascites na uvimbe (CD45−). (E na F) EpCAM + CD45-tumor na EpCAM-CD45-matrix ufyonzaji wa glukosi (2-NBDG) (E) na shughuli za mitochondria (MitoTracker nyekundu iliyokolea) (F) grafu wakilishi (kushoto) na data iliyoorodheshwa (Kulia) Ascites na seli za uvimbe. (G) Grafu wakilishi za usemi wa CD25, CD137 na PD1 kwa kutumia saitometri ya mtiririko. (H na I) Usemi wa CD25, CD137 na PD1 kwenye seli za CD4 + T (H) na seli za CD8 + T (I). (J na K) Aina za kumbukumbu ya kati isiyo na uzoefu, isiyo na uzoefu (Tcm), inayoathiri (Teff) na kumbukumbu ya athari (Tem) kulingana na usemi wa CCR7 na CD45RO. Picha wakilishi (kushoto) na data ya jedwali (kulia) ya seli za CD4 + T (J) na seli za CD8 + T (K) katika ascites na uvimbe. Thamani za P zinaamuliwa kwa jaribio la t lililooanishwa (*P<0.05, **P<0.01 na ***P<0.001). Mstari unawakilisha wagonjwa waliolingana (n = 6). FMO, mwangaza ukiondoa moja; MFI, kiwango cha wastani cha mwangaza.
Uchambuzi zaidi ulifichua tofauti zingine muhimu kati ya hali ya phenotypic ya seli T iliyotatuliwa sana. Kumbukumbu iliyoamilishwa (Mchoro 1, G hadi I) na kumbukumbu ya athari (Mchoro 1, J na K) katika uvimbe ni ya kawaida zaidi kuliko ascites (idadi ya seli za CD3 + T). Vile vile, kuchambua phenotype kwa usemi wa alama za uanzishaji (CD25 na CD137) na alama za kupungua [protini ya kifo cha seli iliyopangwa 1 (PD1)] ilionyesha kuwa ingawa sifa za kimetaboliki za idadi hizi ni tofauti (Mchoro S1, B hadi E), Lakini hakuna tofauti kubwa za kimetaboliki zilizozingatiwa mara kwa mara kati ya sehemu ndogo za naive, effector au kumbukumbu (Mchoro S1, F hadi I). Matokeo haya yalithibitishwa kwa kutumia mbinu za kujifunza kwa mashine ili kugawa kiotomatiki phenotypes za seli (21), ambayo ilifunua zaidi uwepo wa idadi kubwa ya seli za uboho (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) katika ascites ya mgonjwa (Mchoro S2A). Miongoni mwa aina zote za seli zilizotambuliwa, idadi hii ya seli za myeloidi ilionyesha ufyonzaji wa glukosi mwingi na shughuli za mitochondria (Mchoro S2, B hadi G). Matokeo haya yanaonyesha tofauti kubwa za kimetaboliki kati ya aina nyingi za seli zinazopatikana katika ascites na uvimbe kwa wagonjwa wa HGSC.
Changamoto kuu katika kuelewa sifa za kimetaboliki za TIL ni hitaji la kutenga sampuli za seli T zenye usafi wa kutosha, ubora na wingi kutoka kwa uvimbe. Uchunguzi wa hivi karibuni umeonyesha kuwa mbinu za upangaji na uboreshaji wa shanga kulingana na saitometri ya mtiririko zinaweza kusababisha mabadiliko katika wasifu wa metaboliti za seli (22-24). Ili kushinda tatizo hili, tuliboresha mbinu ya uboreshaji wa shanga ili kutenga na kutenga TIL kutoka kwa saratani ya ovari ya binadamu iliyoondolewa kwa upasuaji kabla ya uchambuzi na LC-MS/MS (tazama Nyenzo na Mbinu; Mchoro 2A). Ili kutathmini athari ya jumla ya itifaki hii kwenye mabadiliko ya metaboliti, tulilinganisha wasifu wa metaboliti wa seli T zilizoamilishwa na wafadhili wenye afya baada ya hatua ya utenganishaji wa shanga hapo juu na seli ambazo hazikutengwa na shanga lakini zilibaki kwenye barafu. Uchambuzi huu wa udhibiti wa ubora uligundua kuwa kuna uhusiano mkubwa kati ya hali hizi mbili (r = 0.77), na urudiaji wa kiufundi wa kundi la metaboliti 86 una urudiaji mkubwa (Mchoro 2B). Kwa hivyo, mbinu hizi zinaweza kufanya uchambuzi sahihi wa kimetaboli katika seli zinazopitia uboreshaji wa aina ya seli, hivyo kutoa jukwaa la kwanza la ubora wa juu la kutambua metaboli maalum katika HGSC, na hivyo kuwawezesha watu kupata uelewa wa kina wa upekee wa seli. Programu ya kimetaboliki ya ngono.
(A) Mchoro wa kimkakati wa uboreshaji wa shanga za sumaku. Kabla ya uchambuzi na LC-MS/MS, seli zitapitia raundi tatu mfululizo za uboreshaji wa shanga za sumaku au zitabaki kwenye barafu. (B) Athari ya aina ya uboreshaji kwenye wingi wa metaboliti. Wastani wa vipimo vitatu kwa kila aina ya uboreshaji ± SE. Mstari wa kijivu unawakilisha uhusiano wa 1:1. Uwiano wa ndani ya darasa (ICC) wa vipimo vinavyorudiwa vinavyoonyeshwa kwenye lebo ya mhimili. NAD, nikotinamidi adenine dinucleotide. (C) Mchoro wa kimkakati wa mtiririko wa uchambuzi wa metaboliti ya mgonjwa. Ascites au uvimbe hukusanywa kutoka kwa wagonjwa na kuhifadhiwa. Sehemu ndogo ya kila sampuli ilichambuliwa kwa kutumia saitometri ya mtiririko, huku sampuli zilizobaki zikipitia raundi tatu za uboreshaji kwa seli za CD4+, CD8+ na CD45. Sehemu hizi za seli zilichambuliwa kwa kutumia LC-MS/MS. (D) Ramani ya joto ya wingi wa metaboliti sanifu. Dendrogramu inawakilisha mkusanyiko wa Ward wa umbali wa Euclidean kati ya sampuli. (E) Uchambuzi mkuu wa vipengele (PCA) wa ramani ya metaboliti ya sampuli, inayoonyesha nakala tatu za kila sampuli, sampuli kutoka kwa mgonjwa yule yule zimeunganishwa kwa mstari. (F) PCA ya wasifu wa metaboliti ya sampuli kulingana na mgonjwa (yaani, kwa kutumia upungufu wa sehemu); aina ya sampuli imepunguzwa na mwili uliopinda. PC1, sehemu kuu 1; PC2, sehemu kuu 2.
Kisha, tulitumia mbinu hii ya uboreshaji kuchambua metaboli 99 katika sehemu za seli za CD4+, CD8+ na CD45 katika ascites na uvimbe wa msingi wa wagonjwa sita wa HGSC (Mchoro 2C, Mchoro S3A na Jedwali S3 na S4). Idadi ya watu wanaovutiwa inachangia 2% hadi 70% ya sampuli kubwa ya awali ya seli hai, na uwiano wa seli hutofautiana sana kati ya wagonjwa. Baada ya kutenganisha shanga, sehemu iliyoimarishwa ya uvutiaji (CD4+, CD8+ au CD45-) inachangia zaidi ya 85% ya seli zote hai katika sampuli kwa wastani. Njia hii ya uboreshaji inaturuhusu kuchambua idadi ya seli kutoka kwa kimetaboliki ya tishu za uvimbe wa binadamu, ambayo haiwezekani kufanya kutoka kwa sampuli kubwa. Kwa kutumia itifaki hii, tuliamua kwamba l-kynurenine na adenosine, metaboli hizi mbili za kukandamiza kinga zilizo na sifa nzuri ziliongezeka katika seli za T za uvimbe au seli za uvimbe (Mchoro S3, B na C). Kwa hivyo, matokeo haya yanaonyesha uaminifu na uwezo wa utengano wa seli zetu na teknolojia ya spektrometri ya wingi kupata metaboli muhimu kibiolojia katika tishu za wagonjwa.
Uchambuzi wetu pia ulifunua utengano mkubwa wa kimetaboliki wa aina za seli ndani na kati ya wagonjwa (Mchoro 2D na Mchoro S4A). Hasa, ikilinganishwa na wagonjwa wengine, mgonjwa 70 alionyesha sifa tofauti za kimetaboliki (Mchoro 2E na Mchoro S4B), ikionyesha kwamba kunaweza kuwa na tofauti kubwa ya kimetaboliki kati ya wagonjwa. Ni muhimu kuzingatia kwamba ikilinganishwa na wagonjwa wengine (lita 1.2 hadi 2; Jedwali S1), jumla ya ascites zilizokusanywa kwa mgonjwa 70 (80 ml) ilikuwa ndogo. Udhibiti wa tofauti kati ya wagonjwa wakati wa uchambuzi wa vipengele vikuu (kwa mfano, kwa kutumia uchanganuzi wa upungufu wa sehemu) unaonyesha mabadiliko thabiti kati ya aina za seli, na aina za seli na/au mazingira madogo yamekusanywa wazi kulingana na wasifu wa kimetaboliki (Mchoro 2F). Uchanganuzi wa metaboliti moja ulisisitiza athari hizi na kufichua tofauti kubwa kati ya aina za seli na mazingira madogo. Ni muhimu kuzingatia kwamba tofauti kubwa zaidi inayoonekana ni MNA, ambayo kwa kawaida hutajiriwa katika seli za CD45 na katika seli za CD4+ na CD8+ zinazoingia kwenye uvimbe (Mchoro 3A). Kwa seli za CD4 +, athari hii ni dhahiri zaidi, na MNA katika seli za CD8 + pia inaonekana kuathiriwa sana na mazingira. Hata hivyo, hii si muhimu, kwa sababu ni wagonjwa watatu tu kati ya sita wanaweza kutathminiwa kwa alama za uvimbe wa CD8+. Mbali na MNA, katika aina tofauti za seli katika ascites na uvimbe, metaboliti zingine ambazo hazijabainishwa vizuri katika TIL pia zina utajiri tofauti (Michoro S3 na S4). Kwa hivyo, data hizi zinaonyesha seti inayoahidi ya metaboliti za kinga mwilini kwa ajili ya utafiti zaidi.
(A) Kiwango cha kawaida cha MNA katika seli za CD4+, CD8+ na CD45- kutoka kwa ascites na uvimbe. Mchoro wa kisanduku unaonyesha wastani (mstari), masafa ya kati ya robo (bawaba ya fremu) na masafa ya data, hadi mara 1.5 ya masafa ya kati ya robo (fremu whisker). Kama ilivyoelezwa katika Nyenzo na Mbinu za Mgonjwa, tumia thamani ya limma ya mgonjwa kubaini thamani ya P (*P<0.05 na **P<0.01). (B) Mchoro wa kimkakati wa umetaboli wa MNA (60). Metabolites: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nikotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, ribose ya nikotinamide; NMN, mononukleotidi ya nikotinamide. Vimeng'enya (kijani): NNMT, nikotinamidi N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nikotinamidi phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nikotinamidi ribosidi kinase; NMNAT, nikotinamidi mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE ya scRNA-seq ya ascites (kijivu) na uvimbe (nyekundu; n = wagonjwa 3). (D) Usemi wa NNMT katika idadi tofauti ya seli zilizotambuliwa kwa kutumia scRNA-seq. (E) Usemi wa NNMT na AOX1 katika SK-OV-3, figo ya kiinitete ya binadamu (HEK) 293T, seli T na seli T zilizotibiwa na MNA. Usemi uliokunjwa unaonyeshwa ukilinganisha na SK-OV-3. Muundo wa usemi na SEM unaonyeshwa (n = wafadhili 6 wenye afya). Thamani za Ct zaidi ya 35 zinachukuliwa kuwa hazigunduliki (UD). (F) Usemi wa SLC22A1 na SLC22A2 katika SK-OV-3, HEK293T, seli T na seli T zilizotibiwa na MNA ya 8mM. Usemi uliokunjwa unaonyeshwa ukilinganisha na SK-OV-3. Muundo wa usemi na SEM unaonyeshwa (n = wafadhili 6 wenye afya). Thamani za Ct zaidi ya 35 zinachukuliwa kuwa hazigunduliki (UD). (G) Kiwango cha MNA ya seli katika seli T za wafadhili wenye afya zilizoamilishwa baada ya saa 72 za kuanguliwa na MNA. Muundo wa usemi na SEM unaonyeshwa (n = wafadhili 4 wenye afya).
MNA huzalishwa kwa kuhamisha kundi la methyl kutoka S-adenosyl-1-methionine (SAM) hadi nikotinamidi (NA) kupitia nikotinamidi N-methyltransferase (NNMT; Mchoro 3B). NNMT imeenea sana katika aina mbalimbali za saratani za binadamu na inahusishwa na kuenea, uvamizi na metastasis (25-27). Ili kuelewa vyema chanzo cha MNA katika seli za T katika TME, tulitumia scRNA-seq kuainisha usemi wa NNMT katika aina za seli katika ascites na uvimbe wa wagonjwa watatu wa HGSC (Jedwali S5). Uchambuzi wa takriban seli 6,500 ulionyesha kuwa katika mazingira ya ascites na uvimbe, usemi wa NNMT ulizuiliwa kwa idadi inayodhaniwa ya fibroblast na seli za uvimbe (Mchoro 3, C na D). Inafaa kuzingatia kwamba hakuna usemi dhahiri wa NNMT katika idadi yoyote inayoonyesha PTPRC (CD45 +) (Mchoro 3D na Mchoro S5A), ambayo inaonyesha kwamba MNA iliyogunduliwa katika wigo wa kimetaboliki imeingizwa kwenye seli za T. Usemi wa aldehyde oksidasi 1 (AOX1) hubadilisha MNA kuwa 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) au 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Mchoro 3B) pia umepunguzwa kwa idadi ya fibroblasti zinazoonyesha COL1A1 (Mchoro S5A), ambazo kwa pamoja zinaonyesha kuwa seli T hazina uwezo wa kimetaboliki ya kawaida ya MNA. Muundo wa usemi wa jeni hizi zinazohusiana na MNA ulithibitishwa kwa kutumia seti ya pili ya data ya seli huru kutoka kwa ascites kutoka kwa wagonjwa wa HGSC (Mchoro S5B; n = 6) (16). Kwa kuongezea, uchambuzi wa mmenyuko wa mnyororo wa polimaase wa kiasi (qPCR) wa seli T za wafadhili wenye afya waliotibiwa na MNA ulionyesha kuwa ikilinganishwa na seli za uvimbe wa ovari za SK-OV-3 zinazodhibitiwa, NNMT au AOX1 hazikuonyeshwa kabisa (Mchoro 3E). Matokeo haya yasiyotarajiwa yanaonyesha kuwa MNA inaweza kutolewa kutoka kwa fibroblasti au uvimbe hadi kwenye seli T zilizo karibu katika TME.
Ingawa wagombea ni pamoja na familia ya wasafirishaji wa kasheni hai 1 hadi 3 (OCT1, OCT2 na OCT3) waliosimbwa na familia ya kibebaji kinachoyeyuka 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 na SLC22A3), wasafirishaji wanaowezekana wa MNA bado hawajafafanuliwa (28). QPCR ya mRNA kutoka kwa seli T za wafadhili wenye afya ilionyesha viwango vya chini vya usemi wa SLC22A1 lakini viwango visivyoonekana vya SLC22A2, ambavyo vilithibitisha kwamba ilikuwa imeripotiwa hapo awali katika machapisho (Mchoro 3F) (29). Kwa upande mwingine, mstari wa seli ya uvimbe wa ovari ya SK-OV-3 ulionyesha viwango vya juu vya wasafirishaji wote wawili (Mchoro 3F).
Ili kujaribu uwezekano wa seli T kuwa na uwezo wa kunyonya MNA ya kigeni, seli T za wafadhili zenye afya zilikuzwa kwa saa 72 mbele ya viwango tofauti vya MNA. Kwa kukosekana kwa MNA ya nje, kiwango cha seli cha MNA hakiwezi kugunduliwa (Mchoro 3G). Hata hivyo, seli T zilizoamilishwa zilizotibiwa na MNA ya nje zilionyesha ongezeko linalotegemea kipimo cha kiwango cha MNA katika seli, hadi MNA 6 mM (Mchoro 3G). Matokeo haya yanaonyesha kwamba licha ya kiwango cha chini cha usemi wa kisafirishaji na ukosefu wa kimeng'enya kikuu kinachohusika na umetaboli wa MNA ndani ya seli, TIL bado inaweza kuchukua MNA.
Wigo wa metaboliti katika seli T za wagonjwa na majaribio ya unyonyaji wa MNA ndani ya vitro huongeza uwezekano kwamba fibroblasti zinazohusiana na saratani (CAF) hutoa MNA na seli za uvimbe zinaweza kudhibiti aina na utendaji kazi wa TIL. Ili kubaini athari ya MNA kwenye seli T, seli T za wafadhili wenye afya ziliamilishwa ndani ya vitro mbele au kutokuwepo kwa MNA, na kuenea kwao na uzalishaji wa saitokini vilitathminiwa. Baada ya siku 7 za kuongeza MNA kwa kipimo cha juu zaidi, idadi ya watu iliyoongezeka maradufu ilipunguzwa kwa kiasi, huku nguvu ikidumishwa katika vipimo vyote (Mchoro 4A). Zaidi ya hayo, matibabu ya MNA ya nje yalisababisha ongezeko la idadi ya seli za CD4 + na CD8 + T zinazoonyesha kipengele cha necrosis ya uvimbe-α (TNFα; Mchoro 4B). Kwa upande mwingine, uzalishaji wa ndani ya seli wa IFN-γ ulipunguzwa kwa kiasi kikubwa katika seli za CD4 + T, lakini si katika seli za CD8 + T, na hakukuwa na mabadiliko makubwa katika interleukin 2 (IL-2; Mchoro 4, C na D). Kwa hivyo, kipimo cha kinga kinachounganishwa na kimeng'enya (ELISA) cha supernati kutoka kwa tamaduni hizi za seli za T zilizotibiwa na MNA kilionyesha ongezeko kubwa la TNFα, kupungua kwa IFN-γ, na hakuna mabadiliko katika IL-2 (Mchoro 4, E hadi G). . Kupungua kwa IFN-γ kunaonyesha kuwa MNA inaweza kuchukua jukumu katika kuzuia shughuli za kupambana na uvimbe za seli za T. Ili kuiga athari ya MNA kwenye sumu ya seli za T inayosababishwa na seli za T, seli za kipokezi cha antijeni cha chimeriki T (FRα-CAR-T) zinazolenga kipokezi cha folate α na seli za CAR-T (GFP) zinazodhibitiwa na protini ya kijani kibichi ya fluorescent (GFP) -CAR-T) huzalishwa na seli zenye afya za damu za pembeni za wafadhili (PBMC). Seli za CAR-T zilikuzwa kwa saa 24 mbele ya MNA, na kisha zilikuzwa pamoja na seli za uvimbe wa ovari za binadamu za SK-OV-3 zinazoonyesha kipokezi cha folate α kwa uwiano wa kitendaji hadi lengo la 10:1. Matibabu ya MNA yalisababisha kupungua kwa kiasi kikubwa kwa shughuli ya kuua seli za FRα-CAR-T, ambayo ilikuwa sawa na seli za FRα-CAR-T zilizotibiwa na adenosine (Mchoro 4H).
(A) Jumla ya idadi ya seli zinazoweza kutumika na ongezeko la idadi ya watu (PD) moja kwa moja kutoka kwa tamaduni siku ya 7. Grafu ya upau inawakilisha wastani + SEM ya wafadhili sita wenye afya. Inawakilisha data kutoka kwa angalau majaribio ya n = 3 huru. (B hadi D) CD3/CD28 na IL-2 zilitumika kuamilisha seli T katika viwango vyao vya MNA kwa siku 7. Kabla ya uchambuzi, seli zilichochewa na PMA/ionomycin na GolgiStop kwa saa 4. Usemi wa TNFα (B) katika seli T. Mfano wa picha (kushoto) na data ya jedwali (kulia) ya usemi wa TNFα katika seli hai. Usemi wa IFN-γ (C) na IL-2 (D) katika seli T. Usemi wa saitokini ulipimwa kwa saitometri ya mtiririko. Grafu ya upau inawakilisha wastani (n = wafadhili 6 wenye afya) + SEM. Tumia uchanganuzi wa njia moja wa tofauti na vipimo vinavyorudiwa (*P<0.05 na **P<0.01) ili kubaini thamani ya P. Inawakilisha data kutoka kwa majaribio ya angalau n = 3 huru. (E hadi G) CD3/CD28 na IL-2 zilitumika kuamilisha seli T katika viwango vyao vya MNA kwa siku 7. Kifaa hicho kilikusanywa kabla na baada ya saa 4 za kuchochea PMA/ionomycin. Viwango vya TNFα (E), IFN-γ (F) na IL-2 (G) vilipimwa na ELISA. Grafu ya upau inawakilisha wastani (n = wafadhili 5 wenye afya) + SEM. Thamani ya P iliamuliwa kwa kutumia uchanganuzi wa njia moja wa tofauti na vipimo vinavyorudiwa (*P<0.05). Mstari ulio na nukta unaonyesha kikomo cha kugundua. (H) Kipimo cha lysis ya seli. Seli za FRα-CAR-T au GFP-CAR-T zilirekebishwa na adenosine (250μM) au MNA (10 mM) kwa saa 24, au hazikutibiwa (Ctrl). Asilimia ya mauaji ya seli za SK-OV-3 ilipimwa. Thamani ya P iliamuliwa na jaribio la Welch t (*P<0.5 na **P<0.01).
Ili kupata uelewa wa kiufundi wa udhibiti wa usemi wa TNFα unaotegemea MNA, mabadiliko katika mRNA ya TNFα ya seli T zilizotibiwa na MNA yalitathminiwa (Mchoro 5A). Seli T za wafadhili wenye afya zilizotibiwa na MNA zilionyesha ongezeko mara mbili la viwango vya unukuzi wa TNFα, ikionyesha kuwa MNA inategemea udhibiti wa unukuzi wa TNFα. Ili kuchunguza utaratibu huu unaowezekana wa udhibiti, vipengele viwili vinavyojulikana vya unukuzi vinavyodhibiti TNFα, yaani kipengele cha nyuklia cha seli T kilichoamilishwa (NFAT) na protini maalum 1 (Sp1), vilitathminiwa ili kujibu kufungamana kwa MNA na kipandishi cha TNFα cha karibu (30). Kipandishi cha TNFα kina maeneo 6 yaliyotambuliwa ya kufungamana na NFAT na maeneo 2 ya kufungamana ya Sp1, yakiingiliana katika eneo moja [-55 jozi za msingi (bp) kutoka kwa 5'cap] (30). Kinga ya kinga ya chromatin (ChIP) ilionyesha kuwa wakati wa kutibiwa na MNA, kufungamana kwa Sp1 na kipandishi cha TNFα kuliongezeka mara tatu. Kuingizwa kwa NFAT pia kuliongezeka na kukaribia umuhimu (Mchoro 5B). Takwimu hizi zinaonyesha kwamba MNA hudhibiti usemi wa TNFα kupitia unukuzi wa Sp1, na kwa kiwango kidogo usemi wa NFAT.
(A) Ikilinganishwa na seli T zilizokuzwa bila MNA, mabadiliko ya mkunjo wa usemi wa TNFα katika seli T zilizotibiwa na MNA. Muundo wa usemi na SEM unaonyeshwa (n = wafadhili 5 wenye afya). Inawakilisha data kutoka kwa angalau majaribio n = 3 huru. (B) Kichocheo cha TNFα cha seli T kilichotibiwa na au bila MNA 8 mM baada ya NFAT na Sp1 kuunganishwa na (Ctrl) na kichocheo cha PMA/ionomycin kwa saa 4. Immunoglobulin G (IgG) na H3 zilitumika kama vidhibiti hasi na chanya kwa ajili ya kinga, mtawalia. Upimaji wa ChIP ulionyesha kuwa kufungamana kwa Sp1 na NFAT kwa kichocheo cha TNFα katika seli zilizotibiwa na MNA kuliongezeka mara kadhaa ikilinganishwa na udhibiti. Inawakilisha data kutoka kwa majaribio angalau n = 3 huru. Thamani ya P imedhamiriwa na vipimo vingi vya t (*** P <0.01). (C) Ikilinganishwa na ascites ya HGSC, seli T (zisizo na sumu) zilionyesha ongezeko la usemi wa TNF katika uvimbe. Rangi zinawakilisha wagonjwa tofauti. Seli zilizoonyeshwa zimechukuliwa sampuli bila mpangilio hadi 300 na kutikiswa ili kupunguza uvutaji kupita kiasi (** Padj = 0.0076). (D) Mfano uliopendekezwa wa MNA kwa saratani ya ovari. MNA huzalishwa katika seli za uvimbe na fibroblasti katika TME na huchukuliwa na seli T. MNA huongeza ufungamano wa Sp1 kwa kichocheo cha TNFα, na kusababisha kuongezeka kwa unukuzi wa TNFα na uzalishaji wa saitokini ya TNFα. MNA pia husababisha kupungua kwa IFN-γ. Kuzuiwa kwa utendaji kazi wa seli T husababisha kupungua kwa uwezo wa kuua na ukuaji wa uvimbe haraka.
Kulingana na ripoti, TNFα ina athari za kupambana na uvimbe na kupambana na uvimbe zinazotegemea mbele na nyuma, lakini ina jukumu linalojulikana katika kukuza ukuaji na kuenea kwa saratani ya ovari (31-33). Kulingana na ripoti, mkusanyiko wa TNFα katika ascites na tishu za uvimbe kwa wagonjwa walio na saratani ya ovari ni mkubwa kuliko ule ulio katika tishu zisizo na madhara (34-36). Kwa upande wa utaratibu, TNFα inaweza kudhibiti uanzishaji, utendakazi na kuenea kwa seli nyeupe za damu, na kubadilisha aina ya seli za saratani (37, 38). Sambamba na matokeo haya, uchanganuzi wa tofauti wa usemi wa jeni ulionyesha kuwa TNF iliongezeka kwa kiasi kikubwa katika seli T katika tishu za uvimbe ikilinganishwa na ascites (Mchoro 5C). Ongezeko la usemi wa TNF lilionekana tu katika idadi ya seli T zenye aina isiyo na sumu (Mchoro S5A). Kwa muhtasari, data hizi zinaunga mkono mtazamo kwamba MNA ina athari mbili za kukandamiza kinga na kukuza uvimbe katika HGSC.
Uwekaji lebo wa mwangaza kulingana na saitometri ya mtiririko umekuwa njia kuu ya kusoma umetaboli wa TIL. Masomo haya yameonyesha kuwa ikilinganishwa na limfositi za damu za pembeni au seli T kutoka kwa viungo vya lymphoid vya sekondari, panya na TIL za binadamu zina mwelekeo mkubwa wa kunyonya glukosi (4, 39) na upotevu wa taratibu wa utendaji kazi wa mitochondrial (19, 40). Ingawa tumeona matokeo kama hayo katika utafiti huu, maendeleo muhimu ni kulinganisha umetaboli wa seli za uvimbe na TIL kutoka kwa tishu zile zile za uvimbe zilizoondolewa. Sambamba na baadhi ya ripoti hizi za awali, seli za uvimbe (CD45-EpCAM +) kutoka kwa ascites na uvimbe zina unyonyaji mkubwa wa glukosi kuliko seli za CD8+ na CD4+ T, na kuunga mkono kwamba unyonyaji mkubwa wa glukosi wa seli za uvimbe unaweza kulinganishwa na seli T. Wazo la ushindani wa seli T. TME. Hata hivyo, shughuli ya mitochondrial ya seli za uvimbe ni kubwa kuliko ile ya seli za CD8+ T, lakini shughuli ya mitochondrial ni sawa na ile ya seli za CD4+ T. Matokeo haya yanaimarisha mada inayoibuka kwamba umetaboli wa oksidi ni muhimu kwa seli za uvimbe (41, 42). Pia zinaonyesha kwamba seli za CD8 + T zinaweza kuwa katika hatari zaidi ya kutofanya kazi vizuri kwa oksidi kuliko seli za CD4 + T, au kwamba seli za CD4 + T zinaweza kutumia vyanzo vya kaboni zaidi ya glukosi ili kudumisha shughuli za mitochondria (43, 44). Ikumbukwe kwamba hatukuona tofauti yoyote katika ufyonzaji wa glukosi au shughuli za mitochondria kati ya vitendaji vya CD4 + T, kumbukumbu ya kitendaji cha T na seli za kumbukumbu kuu za T katika ascites. Vile vile, hali ya utofautishaji wa seli za CD8 + T katika uvimbe haihusiani na mabadiliko katika ufyonzaji wa glukosi, ikionyesha tofauti kubwa kati ya seli za T zilizokuzwa katika vitro na TIL ya binadamu katika mwili (22). Uchunguzi huu pia ulithibitishwa na matumizi ya mgawanyo wa idadi ya seli kiotomatiki usio na upendeleo, ambayo ilifunua zaidi kwamba seli za CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + zenye ufyonzaji mkubwa wa glukosi na shughuli za mitochondria kuliko seli za uvimbe zimeenea lakini zina idadi ya seli hai za kimetaboliki. Idadi hii inaweza kuwakilisha idadi ndogo ya seli zinazokandamiza myeloid au seli za dendritic za plasmacytoid zilizotambuliwa katika uchanganuzi wa scRNA-seq. Ingawa zote mbili zimeripotiwa katika uvimbe wa ovari ya binadamu [45], bado zinahitaji kazi zaidi ni kuelezea idadi ndogo ya mieloidi.
Ingawa mbinu zinazotegemea mtiririko wa saitometri zinaweza kufafanua tofauti za jumla katika kimetaboliki ya glukosi na oksidi kati ya aina za seli, metaboliti sahihi zinazozalishwa na glukosi au vyanzo vingine vya kaboni kwa ajili ya kimetaboliki ya mitochondrial katika TME bado hazijabainishwa. Kugawa uwepo au kutokuwepo kwa metaboliti kwa kikundi fulani cha TIL kunahitaji utakaso wa idadi ya seli kutoka kwa tishu zilizoondolewa. Kwa hivyo, mbinu yetu ya uboreshaji wa seli pamoja na spektrometri ya wingi inaweza kutoa ufahamu kuhusu metaboliti ambazo zimetajirishwa tofauti katika seli T na idadi ya seli za uvimbe katika sampuli zinazolingana za wagonjwa. Ingawa njia hii ina faida zaidi ya upangaji wa seli unaoamilishwa na fluorescence, maktaba fulani za metaboliti zinaweza kuathiriwa kutokana na uthabiti wa asili na/au kiwango cha haraka cha mauzo (22). Hata hivyo, mbinu yetu iliweza kutambua metaboliti mbili zinazokandamiza kinga zinazotambuliwa, adenosine na kynurenine, kwa sababu hutofautiana sana kati ya aina za sampuli.
Uchambuzi wetu wa kimetaboliki wa uvimbe na aina ndogo za TIL hutoa ufahamu zaidi kuhusu jukumu la metaboliti katika TME ya ovari. Kwanza, kwa kutumia saitometri ya mtiririko, tuliamua kwamba hakukuwa na tofauti katika shughuli za mitochondrial kati ya uvimbe na seli za CD4 + T. Hata hivyo, uchambuzi wa LC-MS/MS ulionyesha mabadiliko makubwa katika wingi wa metaboliti miongoni mwa watu hawa, ikionyesha kwamba hitimisho kuhusu metaboliti ya TIL na shughuli zake za kimetaboliki kwa ujumla zinahitaji tafsiri makini. Pili, MNA ndiyo metaboliti yenye tofauti kubwa zaidi kati ya seli za CD45 na seli za T katika ascites, si uvimbe. Kwa hivyo, mgawanyiko na eneo la uvimbe vinaweza kuwa na athari tofauti kwenye metaboliti ya TIL, ambayo inaonyesha tofauti zinazowezekana katika mazingira madogo fulani. Tatu, usemi wa kimeng'enya kinachozalisha MNA NNMT umepunguzwa sana kwa CAF, ambayo ni seli za uvimbe kwa kiwango kidogo, lakini viwango vya MNA vinavyoweza kugunduliwa huzingatiwa katika seli za T zinazotokana na uvimbe. Usemi mwingi wa NNMT katika CAF ya ovari una athari inayojulikana ya kukuza saratani, kwa sehemu kutokana na kukuza metaboliti ya CAF, uvamizi wa uvimbe na metastasis (27). Ingawa kiwango cha jumla cha TIL ni cha wastani, usemi wa NNMT katika CAF unahusiana kwa karibu na aina ya mesenchymal ya Saratani ya Atlas ya Jenomu (TCGA), ambayo inahusishwa na ubashiri mbaya (27, 46, 47). Hatimaye, usemi wa kimeng'enya AOX1 kinachohusika na uharibifu wa MNA pia ni mdogo kwa idadi ya CAF, ambayo inaonyesha kwamba seli T hazina uwezo wa kumetaboli MNA. Matokeo haya yanaunga mkono wazo kwamba ingawa kazi zaidi inahitajika ili kuthibitisha ugunduzi huu, viwango vya juu vya MNA katika seli T vinaweza kuonyesha uwepo wa mazingira madogo ya CAF yanayokandamiza kinga.
Kwa kuzingatia kiwango cha chini cha usemi wa visafirishaji vya MNA na viwango visivyoonekana vya protini muhimu zinazohusika katika umetaboli wa MNA, uwepo wa MNA katika seli za T hautarajiwi. NNMT wala AOX1 hazikuweza kugunduliwa kwa uchambuzi wa scRNA-seq na qPCR inayolengwa ya makundi mawili huru. Matokeo haya yanaonyesha kuwa MNA haijatengenezwa na seli za T, lakini hufyonzwa kutoka kwa TME inayozunguka. Majaribio ya ndani ya vitro yanaonyesha kuwa seli za T huwa na tabia ya kukusanya MNA ya nje.
Uchunguzi wetu wa ndani ya vitro umeonyesha kuwa MNA ya nje husababisha usemi wa TNFα katika seli T na huongeza kufungamana kwa Sp1 na kichocheo cha TNFα. Ingawa TNFα ina kazi zote mbili za kupambana na uvimbe na kupambana na uvimbe, katika saratani ya ovari, TNFα inaweza kukuza ukuaji wa saratani ya ovari (31-33). Kupunguza TNFα katika utamaduni wa seli za uvimbe wa ovari au kuondoa ishara ya TNFα katika mifano ya panya kunaweza kuboresha uzalishaji wa saitokini ya uchochezi inayosababishwa na TNFα na kuzuia ukuaji wa uvimbe (32, 35). Kwa hivyo, katika hali hii, MNA inayotokana na TME inaweza kutenda kama metabolite inayosababisha uchochezi kupitia utaratibu unaotegemea TNFα kupitia kitanzi cha autocrine, na hivyo kukuza kutokea na kuenea kwa saratani ya ovari (31). Kulingana na uwezekano huu, kizuizi cha TNFα kinachunguzwa kama wakala anayeweza kutibu saratani ya ovari (37, 48, 49). Kwa kuongezea, MNA hupunguza sumu ya seli za CAR-T kwa seli za uvimbe wa ovari, na kutoa ushahidi zaidi wa kukandamiza kinga inayosababishwa na MNA. Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha mfano ambapo uvimbe na seli za CAF hutoa MNA kwenye TME ya nje ya seli. Kupitia (i) kichocheo cha ukuaji wa saratani ya ovari kinachosababishwa na TNF na (ii) kizuizi cha shughuli za sumu ya seli ya T inayosababishwa na MNA, hii inaweza kuwa na athari mbili za uvimbe (Mchoro 5D).
Kwa kumalizia, kwa kutumia mchanganyiko wa uboreshaji wa seli haraka, mpangilio wa seli moja na uainishaji wa kimetaboliki, utafiti huu ulifunua tofauti kubwa za kinga mwilini kati ya uvimbe na seli za ascites kwa wagonjwa wa HGSC. Uchambuzi huu wa kina ulionyesha kuwa kuna tofauti katika ufyonzaji wa glukosi na shughuli za mitochondria kati ya seli T, na kubaini MNA kama metaboliti inayojiendesha ya kinga isiyo ya seli. Data hizi zina athari kwa jinsi TME inavyoathiri metaboliti ya seli T katika saratani za binadamu. Ingawa ushindani wa moja kwa moja wa virutubisho kati ya seli T na seli za saratani umeripotiwa, metaboliti zinaweza pia kufanya kazi kama vidhibiti visivyo vya moja kwa moja ili kukuza ukuaji wa uvimbe na pengine kukandamiza majibu ya kinga ya ndani. Maelezo zaidi ya jukumu la utendaji kazi wa metaboliti hizi za udhibiti yanaweza kufungua mikakati mbadala ya kuongeza mwitikio wa kinga dhidi ya uvimbe.
Sampuli za wagonjwa na data za kliniki zilipatikana kupitia hazina ya tishu za uvimbe wa saratani ya BC iliyoidhinishwa na Mtandao wa Hifadhi ya Tishu za Kanada. Kulingana na itifaki iliyoidhinishwa na Kamati ya Maadili ya Utafiti wa Saratani ya BC na Chuo Kikuu cha British Columbia (H07-00463), sampuli zote za wagonjwa na data za kliniki zilipata idhini iliyoandikwa au ziliondoa rasmi idhini yao. Sampuli zimehifadhiwa katika BioBank iliyoidhinishwa (BRC-00290). Sifa za kina za mgonjwa zinaonyeshwa katika Majedwali S1 na S5. Kwa uhifadhi wa cryopreservation, kisu cha ngozi hutumika kutenganisha sampuli ya uvimbe wa mgonjwa na kisha kuisukuma kupitia kichujio cha mikroni 100 ili kupata kusimamishwa kwa seli moja. Ascites ya mgonjwa iliwekwa kwa centrifuge kwa 1500 rpm kwa dakika 10 kwa 4°C ili kuchuja seli na kuondoa supernatant. Seli zilizopatikana kutoka kwa uvimbe na ascites zilihifadhiwa katika seramu ya AB ya binadamu isiyo na joto ya 50% (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) na 10% dimethyl sulfoxide. Viungo hivi vya seli moja vilivyohifadhiwa viliyeyushwa na kutumika kwa ajili ya metabolomiki na uamuzi wa metaboliti ilivyoelezwa hapa chini.
Kifaa kamili kina 0.22 μm iliyochujwa yenye 50:50 iliyoongezewa RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) iliyoongezewa na seramu ya AB ya binadamu isiyoamilishwa na joto ya 10% (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) myeyusho (Thermo Fisher Scientific) na 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) imeongezewa na 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) na 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Kizuizi cha kuchorea cha saitomita ya mtiririko kilikuwa na 0.22μm iliyochujwa ya fosfeti iliyobungwa (PBS; Invitrogen) iliyoongezewa na 3% ya seramu ya AB isiyoamilishwa na joto (Sigma). Kizuizi cha uboreshaji wa seli kinaundwa na PBS iliyochujwa ya 0.22μm na kuongezewa seramu ya AB ya binadamu isiyoamilishwa na joto ya 0.5% (Sigma-Aldrich).
Katika halijoto kamili ya 37°C, seli zilipakwa rangi ya 10 nM MT DR na 100 μM 2-NBDG kwa dakika 30. Kisha, seli zilipakwa rangi ya eF506 yenye uwezo wa kuishi kwa 4°C kwa dakika 15. Zirudishe seli kwenye FC Block (eBioscience) na Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), ongeza kwenye bafa ya kuchorea ya saitomita ya mtiririko (kulingana na maagizo ya mtengenezaji), na uziangushe kwa dakika 10 kwenye halijoto ya kawaida. Zipake rangi seli kwa seti ya kingamwili (Jedwali S2) kwenye bafa ya kuchorea ya saitomita ya mtiririko kwa 4°C kwa dakika 20. Zirudishe seli kwenye bafa ya kuchorea ya saitomita ya mtiririko (Cytek Aurora; usanidi wa 3L-16V-14B-8R) kabla ya uchambuzi. Tumia SpectroFlo na FlowJo V10 kuchanganua data ya hesabu ya seli, na tumia GraphPad Prism 8 kuunda data. Kiwango cha wastani cha mwangaza (MFI) cha 2-NBDG na MT DR kilirekebishwa kwa logi, na kisha jaribio la t lililounganishwa lilitumika kwa ajili ya uchambuzi wa takwimu ili kuhesabu wagonjwa waliolingana. Ondoa makundi yote yenye matukio chini ya 40 kutoka kwa uchambuzi; ingiza thamani ya MFI ya 1 kwa thamani yoyote hasi kabla ya kufanya uchambuzi wa takwimu na taswira ya data.
Ili kuongeza mkakati wa kujifunga kwa mikono wa jopo la mchakato hapo juu, tulitumia maelezo kamili kutoka kwa mti wa kizuizi cha umbo (FAUST) (21) ili kugawa seli kiotomatiki kwa idadi ya watu baada ya kuondoa seli zilizokufa katika FlowJo. Tunadhibiti matokeo kwa mikono ili kuunganisha idadi ya watu ambayo inaonekana imetengwa vibaya (kuchanganya PD1+ na seli za uvimbe wa PD1) na idadi ya watu iliyohifadhiwa. Kila sampuli ina wastani wa seli zaidi ya 2%, kwa jumla ya idadi ya watu 11.
Sentirifugation ya msongamano wa mteremko wa Ficoll ilitumika kutenganisha PBMC na bidhaa za utenganishaji wa leukocyte (STEMCELL Technologies). Seli za CD8 + T zilitengwa kutoka PBMC kwa kutumia CD8 MicroBeads (Miltenyi) na kupanuliwa katika kati kamili kwa kutumia TransAct (Miltenyi) kwa wiki 2 kulingana na maagizo ya mtengenezaji. Seli ziliruhusiwa kusimama kwa siku 5 katika kati kamili iliyo na IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), na kisha kuchochewa tena na TransAct. Siku ya 7, kulingana na maagizo ya mtengenezaji, CD45 MicroBeads za binadamu (Miltenyi) zilitumika kuimarisha seli katika raundi tatu mfululizo. Seli zilitengwa kwa ajili ya uchambuzi wa saitometri ya mtiririko (kama ilivyoelezwa hapo juu), na seli milioni moja zilitengwa mara tatu kwa ajili ya uchambuzi wa LC-MS/MS. Sampuli zilisindikwa na LC-MS/MS kama ilivyoelezwa hapa chini. Tulikadiria thamani ya metabolite iliyokosekana kwa idadi ya ioni 1,000. Kila sampuli hurekebishwa kwa nambari ya ioni jumla (TIC), hubadilishwa kiotomatiki na kurekebishwa kiotomatiki katika MetaboAnalystR kabla ya uchambuzi.
Kiini cha seli moja cha kila mgonjwa kiliyeyushwa na kuchujwa kupitia kichujio cha μm 40 hadi kwenye chombo kamili (kama ilivyoelezwa hapo juu). Kulingana na itifaki ya mtengenezaji, raundi tatu mfululizo za uteuzi chanya kwa kutenganisha shanga za sumaku kwa kutumia MicroBeads (Miltenyi) zilitumika kuongeza sampuli za seli za CD8+, CD4+ na CD45 (kwenye barafu). Kwa kifupi, seli huwekwa tena kwenye bafa ya uboreshaji wa seli (kama ilivyoelezwa hapo juu) na kuhesabiwa. Seli ziliwekwa kwenye bafa ya CD8 ya binadamu, shanga za CD4 ya binadamu au shanga za CD45 ya binadamu (Miltenyi) kwa 4°C kwa dakika 15, na kisha kuoshwa na bafa ya uboreshaji wa seli. Sampuli hupitishwa kupitia safu wima ya LS (Miltenyi), na sehemu chanya na hasi hukusanywa. Ili kupunguza muda na kuongeza hatua ya urejeshaji wa seli, sehemu ya CD8 kisha hutumika kwa raundi ya pili ya uboreshaji wa CD4+, na sehemu ya CD4 hutumika kwa uboreshaji wa CD45 unaofuata. Weka suluhisho kwenye barafu katika mchakato mzima wa utenganisho.
Ili kuandaa sampuli kwa ajili ya uchambuzi wa kimetaboliki, seli zilioshwa mara moja kwa mchanganyiko wa chumvi baridi, na mililita 1 ya methanoli 80% iliongezwa kwenye kila sampuli, kisha ikatolewa kwa mvuke na kugandishwa kwenye nitrojeni kioevu. Sampuli zilifanyiwa mizunguko mitatu ya kugandishwa na kupunguzwa kwa kasi ya 14,000 rpm kwa dakika 15 kwa 4°C. Supernatant iliyo na metaboliti huvukizwa hadi ikauke. Metaboliti ziliyeyushwa tena katika mililita 50 za asidi fomik 0.03%, zikatolewa kwa mvuke ili kuchanganyika, na kisha zikatolewa kwa mvuke ili kuondoa uchafu.
Dondoo metaboliti kama ilivyoelezwa hapo juu. Hamisha supernatant kwenye chupa ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa juu kwa ajili ya utafiti wa metabolomiki. Tumia itifaki ya matibabu ya nasibu kutibu kila sampuli na idadi sawa ya seli ili kuzuia athari za kundi. Tulifanya tathmini ya ubora wa metaboliti za kimataifa iliyochapishwa hapo awali kwenye AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Uchambuzi wa kromatografia na ujumuishaji wa eneo la kilele ulifanywa kwa kutumia programu ya MultiQuant toleo la 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Hesabu ya ioni ya 1000 ilitumika kukadiria thamani ya metaboliti iliyokosekana, na TIC ya kila sampuli ilitumika kuhesabu eneo la kilele lililorekebishwa la kila metaboliti iliyogunduliwa ili kusahihisha mabadiliko yaliyoletwa na uchambuzi wa vifaa kutoka kwa usindikaji wa sampuli. Baada ya TIC kurekebishwa, MetaboAnalystR(51) (kigezo chaguo-msingi) hutumika kwa ubadilishaji wa logarithmic na upimaji wa mstari wa kawaida kiotomatiki. Tulitumia PCA na kifurushi cha R cha vegan kufanya uchambuzi wa uchunguzi wa tofauti za metaboliti kati ya aina za sampuli, na tulitumia uchambuzi wa sehemu ya redundancy kuchambua wagonjwa. Tumia mbinu ya Ward kujenga dendrogramu ya ramani ya joto ili kuunganisha umbali wa Euclidean kati ya sampuli. Tulitumia limma (52) kwenye wingi wa metaboliti sanifu ili kutambua metaboliti nyingi tofauti katika aina nzima ya seli na mazingira madogo. Ili kurahisisha maelezo, tunatumia kigezo cha wastani cha kikundi kutaja modeli, na kuzingatia aina za seli katika mazingira madogo kama kila kundi (n = vikundi 6); Kwa ajili ya jaribio la umuhimu, tulifanya vipimo vitatu vilivyorudiwa kwa kila metaboliti Ili kuepuka uigaji bandia, mgonjwa alijumuishwa kama kikwazo katika muundo wa limma. Ili kuangalia tofauti katika metaboliti kati ya wagonjwa tofauti, tulirekebisha modeli ya limma ikiwa ni pamoja na wagonjwa kwa njia maalum. Tunaripoti umuhimu wa tofauti iliyoainishwa awali kati ya aina ya seli na mazingira madogo ya Padj <0.05 (marekebisho ya Benjamini-Hochberg).
Baada ya kuimarisha nguvu kwa kutumia Kifaa cha Kuondoa Seli Zilizokufa cha Miltenyi (uwezo wa kuishi >80%), mpangilio wa transcriptome ya seli moja ulifanyika kwenye jumla ya ascites zilizogandishwa na sampuli za uvimbe kwa kutumia itifaki ya usemi wa jeni 5'10x. Kesi tano zenye uvimbe na ascites zinazolingana zilichambuliwa, ingawa uwezekano mdogo wa kuishi kutoka kwa sampuli moja ya uvimbe ulizuia kuingizwa kwake. Ili kufikia uteuzi mwingi wa wagonjwa, tuliunganisha sampuli za kila mgonjwa katika njia za kidhibiti cha kromiamu 10x, na kuchanganua ascites na maeneo ya uvimbe kando. Baada ya mpangilio [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), jenomu ya Quebec; wastani wa usomaji 73,488 na 41,378 kwa kila seli kwa uvimbe na ascites mtawalia]], tulitumia CellSNP na Vireo (53) (kulingana na CellSNP kama SNP ya kawaida ya binadamu (VCF) iliyotolewa na GRCh38 imepewa utambulisho wa wafadhili. Tunatumia SNPRelate kubaini utambulisho wa karibu zaidi (IBS) wa hali ya jenotipu ya mgonjwa (IBS), tukiondoa seli na seli ambazo hazijapewa zilizotambuliwa kama duplexes na kulinganisha wafadhili kati ya ascites na sampuli za uvimbe (54). Kwa msingi wa kazi hii, tulihifadhi visa vitatu vyenye uwakilishi mwingi wa seli katika uvimbe na ascites kwa ajili ya uchambuzi wa chini. Baada ya kufanya hatua ya kuchuja kwa wingi katika kifungashio cha scater (55) na scran (56) BioConductor, hii ilitoa seli 6975 (seli 2792 na 4183 kutoka kwa uvimbe na ascites, mtawalia) kwa ajili ya uchambuzi. Tunatumia igraph's (57) Louvain clustering ya mtandao wa jirani wa karibu (SNN) unaoshirikiwa kulingana na Jaccard. umbali hadi kwenye seli za kundi kwa usemi. Makundi yaliandikwa kwa mikono kwa aina za seli zinazodhaniwa kulingana na usemi wa jeni la alama na kuonyeshwa kwa kutumia t-SNE. Seli T zenye sumu hufafanuliwa kwa usemi wa CD8A na GZMA, bila kujumuisha makundi madogo yenye usemi mdogo wa protini ya ribosomal. Tulifikia data iliyochapishwa ya Izar et al. (16), ikiwa ni pamoja na upachikaji wao wa t-SNE, unaweza kudhibiti mwingiliano wa usemi kati ya alama za seli za kinga na usemi wa NNMT.
PBMC zilitenganishwa na bidhaa za utenganishaji wa leukocyte (STEMCELL Technologies) kwa kutumia centrifugation ya msongamano wa gradient ya Ficoll. Seli za CD3+ zilitengwa kutoka PBMC kwa kutumia shanga za CD3 (Miltenyi). Katika uwepo au kutokuwepo kwa MNA, seli za CD3+ ziliamilishwa na CD3 iliyofungwa kwenye plate (5μg/ml), CD28 mumunyifu (3μg/ml) na IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Siku ya mwisho ya upanuzi, uwezekano wa kuishi (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) na kuongezeka (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) zilitathminiwa kwa kutumia flow cytometry. Tathmini utendaji kazi wa kichocheo kwa kuchochea seli zenye PMA (20 ng/ml) na ionomycin (1μg/ml) ukitumia GolgiStop kwa saa 4, na ufuatilie CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) na TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Chochea seli za qPCR na ChIP ukitumia PMA (20 ng/ml) na ionomycin (1μg/ml) kwa saa 4. Kidonge cha ELISA kilikusanywa kabla na baada ya kuchochea na PMA (20 ng/ml) na ionomycin (1 μg/ml) kwa saa 4.
Fuata itifaki ya mtengenezaji ili kutenganisha RNA kwa kutumia RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Tumia QIAshredder (QIAGEN) ili kuoanisha sampuli. Tumia kititi cha RNA chenye uwezo wa juu hadi cDNA (Thermo Fisher Scientific) ili kusanisi DNA inayosaidiana (cDNA). Tumia TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ili kupima usemi wa jeni (kulingana na itifaki ya mtengenezaji) ukitumia probes zifuatazo: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] na Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sampuli ziliendeshwa kwenye mfumo wa PCR wa StepOnePlus wa muda halisi (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) katika bamba la mmenyuko la MicroAmp fast optical 96-well (Applied Biosystems) lenye filamu ya macho ya MicroAmp. Thamani yoyote ya Ct inayozidi 35 inachukuliwa kuwa juu ya kizingiti cha kugundua na imewekwa alama kama isiyoweza kugunduliwa.
Fanya ChIP kama ilivyoelezwa hapo awali (58). Kwa kifupi, seli zilitibiwa na formaldehyde (kiwango cha mwisho cha 1.42%) na kuwekwa kwenye joto la kawaida kwa dakika 10. Tumia kizuizi cha uvimbe kilichoongezwa (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl na 0.1% NP-40) kwenye barafu kwa dakika 10, kisha uirudishe kwenye kizuizi cha kinga kama ilivyoelezwa (58). Kisha sampuli iliwekwa kwa kutumia mizunguko ifuatayo: mizunguko 10 (mapigo 20 ya sekunde 1) na muda tuli wa sekunde 40. Ingia immunoglobulin G ya daraja la ChIP (Teknolojia ya Ishara ya Seli; 1μl), histone H3 (Teknolojia ya Ishara ya Seli; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) na kingamwili za SP1 (Teknolojia ya Ishara ya Seli; 3μl) huku sampuli ikiwa kwenye joto la 4°CC ikitikiswa usiku kucha. Panda shanga za protini A (Thermo Fisher Scientific) kwa kutumia sampuli kwenye 4°C kwa kutikisa kwa upole kwa saa 1, kisha tumia shanga za chelex (Bio-Rad) ili kuimarisha DNA, na tumia protini K (Thermo Fisher) kwa ajili ya usagaji wa protini. Kichocheo cha TNFα kiligunduliwa na PCR: mbele, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; kinyume chake, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (bidhaa ya 207-bp). Picha zilitengenezwa na Image Lab (Bio-Rad) na kupimwa kwa kutumia programu ya ImageJ.
Kipimo cha juu cha uundaji wa seli kilikusanywa kama ilivyoelezwa hapo juu. Uamuzi ulifanyika kulingana na taratibu za mtengenezaji wa kifaa cha TNFα ELISA cha binadamu (Invitrogen), kifaa cha IL-2 ELISA cha binadamu (Invitrogen) na kifaa cha IFN-γ ELISA cha binadamu (Abcam). Kulingana na itifaki ya mtengenezaji, kipimo cha juu cha juu kilipunguzwa 1:100 ili kugundua TNFα na IL-2, na 1:3 ili kugundua IFN-γ. Tumia Kisomaji cha Lebo Nyingi cha EnVision 2104 (PerkinElmer) kupima unyonyaji katika 450 nm.
PBMC zilitenganishwa na bidhaa za utenganishaji wa leukocyte (STEMCELL Technologies) kwa kutumia centrifugation ya msongamano wa gradient ya Ficoll. Seli za CD3+ zilitengwa kutoka PBMC kwa kutumia shanga za CD3 (Miltenyi). Katika uwepo au kutokuwepo kwa MNA, seli za CD3+ ziliamilishwa kwa kutumia CD3 iliyofungwa kwenye sahani (5μg/ml), CD28 mumunyifu (3μg/ml) na IL-2 (300 U/ml; Proleukin) kwa siku 3. Baada ya siku 3, seli zilikusanywa na kuoshwa na saline ya 0.9%, na chembe iligandishwa. Idadi ya seli ilifanywa kwa kutumia saitometri ya mtiririko (Cytek Aurora; usanidi wa 3L-16V-14B-8R) kwa kutumia eBeads 123count.
Dondoo metaboliti kama ilivyoelezwa hapo juu. Dondoo lililokaushwa liliundwa upya kwa mkusanyiko wa seli sawa 4000/μl. Chambua sampuli kwa kutumia kromatografia ya awamu iliyogeuzwa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) na safu wima ya CORTECS T3 (2.1×150 mm, ukubwa wa chembe 1.6-μm, ukubwa wa vinyweleo 120-Å; #186008500, Maji). Spektromita ya uzito wa polar (6470, Agilent), ambapo ioni ya kunyunyizia umeme hufanya kazi katika hali chanya. Awamu ya simu A ni asidi fomiksi 0.1% (katika H2O), awamu ya simu B ni asetonitrile 90%, asidi fomiksi 0.1%. Mteremko wa LC ni dakika 0 hadi 2 kwa 100% A, dakika 2 hadi 7.1 kwa 99% B, na dakika 7.1 hadi 8 kwa 99% B. Kisha linganisha safu wima na awamu inayotembea A kwa kiwango cha mtiririko cha 0.6 ml/dakika kwa dakika 3. . Kiwango cha mtiririko ni 0.4ml/dakika, na chumba cha safu wima hupashwa joto hadi 50°C. Tumia kiwango cha kemikali safi cha MNA (M320995, Kampuni ya Kemikali ya Utafiti ya Toronto, North York, Ontario, Kanada) ili kubaini muda wa kuhifadhi (RT) na mabadiliko (RT = dakika 0.882, mabadiliko 1 = 137→94.1, mabadiliko 2 = 137→92, Ubadilishaji 3 = 137→78). Wakati mabadiliko yote matatu yanapotokea kwa wakati sahihi wa kuhifadhi, mpito 1 hutumika kwa upimaji ili kuhakikisha umahususi. Mkondo sanifu wa MNA (Kampuni ya Kemikali ya Utafiti ya Toronto) ulitolewa kwa michanganyiko sita mfululizo ya myeyusho wa hisa (1 mg/ml) ili kupata viwango vya 0.1, 1.0, 10 na 100 ng/ml na 1.0 na 10μg/ml mtawalia kioevu. Kikomo cha kugundua ni 1 ng/ml, na mwitikio wa mstari ni kati ya 10 ng/ml na 10μg/ml. Kila sindano ya mikrolita mbili za sampuli na kiwango hutumika kwa uchambuzi wa LC/MS, na sampuli mchanganyiko ya udhibiti wa ubora huendeshwa kila sindano nane ili kuhakikisha uthabiti wa jukwaa la uchambuzi. Majibu ya MNA ya sampuli zote za seli zilizotibiwa na MNA yalikuwa ndani ya safu ya mstari ya jaribio. Uchambuzi wa data ulifanyika kwa kutumia programu ya uchambuzi wa kiasi wa MassHunter (v9.0, Agilent).
Muundo wa kizazi cha pili wa αFR-CAR ulichukuliwa kutoka kwa Song et al. (59). Kwa kifupi, muundo una maudhui yafuatayo: mfuatano wa kiongozi wa CD8a, kipande cha kigezo cha mnyororo mmoja maalum wa binadamu wa αFR, bawaba ya CD8a na eneo la transmembrane, kikoa cha ndani ya seli cha CD27 na kikoa cha ndani ya seli cha CD3z. Mfuatano kamili wa CAR uliundwa na GenScript, na kisha kuunganishwa kwenye vekta ya usemi wa lentiviral ya kizazi cha pili juu ya kaseti ya usemi wa GFP inayotumika kutathmini ufanisi wa uhamishaji.
Lentivirus huzalishwa kwa kuhamishiwa seli za HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); hupandwa katika njia ya Dulbecco's modified Eagle medium yenye 10% ya seramu ya ng'ombe ya fetasi (FBS) na 1% PenStrep, na kutumika vekta ya CAR-GFP na plasmids za vifungashio (psPAX2 na pMD2.G, Addgene) hutumia lipofection amine (Sigma-Aldrich). Supernatant yenye virusi ilikusanywa saa 48 na 72 baada ya kuhamishiwa, kuchujwa, na kulimbikizwa kwa ultracentrifugation. Hifadhi supernatant iliyokolea ya virusi kwenye -80°C hadi kuhamishiwa.
PBMC hutenganishwa na bidhaa zenye afya za utenganishaji wa leukocyte wafadhili (STEMCELL Technologies) kwa kutumia centrifugation ya msongamano wa gradient ya Ficoll. Tumia shanga ndogo za CD8 za uteuzi chanya (Miltenyi) ili kutenga seli za CD8+ kutoka PBMC. Chochea seli T kwa kutumia TransAct (Miltenyi) na katika hali ya TexMACS [Miltenyi; iliyoongezewa na seramu ya binadamu isiyo na joto ya 3%, 1% PenStrep na IL-2 (300 U/ml)]. Saa ishirini na nne baada ya kusisimua, seli T zilipitishwa kwa lentivirus (10 μl ya virusi vilivyokolezwa kwa kila seli 106). Siku 1 hadi 3 baada ya kupitisha kwenye Cytek Aurora (kwenye FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), tathmini usemi wa GFP wa seli ili kuonyesha ufanisi wa kupitisha wa angalau 30%.
Seli za CAR-T zilikuzwa kwa saa 24 katika Immunocult (STEMCELL Technologies; zilizoongezewa 1% PenStrep) chini ya hali zifuatazo: bila kutibiwa, kutibiwa na 250 μM adenosine au 10 mM MNA. Baada ya matibabu ya awali, seli za CAR-T zilioshwa na PBS na kuunganishwa na seli 20,000 za SK-OV-3 [ATCC; katika McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) zilizoongezewa 10% FBS na 1% PenStrep kwa 10: Uwiano wa athari kwa lengo la 1 uliongezwa katika nakala tatu katika Immunocult medium iliyoongezewa. Seli za SK-OV-3 na seli za SK-OV-3 zilizopakwa dijitali saponini (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) zilitumika kama vidhibiti hasi na chanya, mtawalia. Baada ya saa 24 za kilimo cha pamoja, supernatant ilikusanywa na lactate dehydrogenase (LDH) ilipimwa kulingana na maagizo ya mtengenezaji (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatant ya LDH ilipunguzwa 1:50 katika bafa ya LDH. Asilimia ya mauaji ilipimwa kwa kutumia fomula ifuatayo: asilimia ya mauaji = asilimia ya marekebisho / kiwango cha juu cha mauaji x 100%, ambapo asilimia ya marekebisho = seli za co-culture-T pekee, na kiwango cha juu cha mauaji = udhibiti chanya wa udhibiti-hasi.
Kama ilivyoelezwa katika maandishi au nyenzo na mbinu, tumia GraphPad Prism 8, Microsoft Excel au R v3.6.0 kwa uchambuzi wa takwimu. Ikiwa sampuli nyingi zinakusanywa kutoka kwa mgonjwa mmoja (kama vile ascites na uvimbe), tunatumia jaribio la t lililounganishwa au kumjumuisha mgonjwa kama athari ya nasibu katika modeli ya mstari au ya jumla inavyofaa. Kwa uchambuzi wa metabolomiki, jaribio la umuhimu hufanywa kwa nakala tatu.
Kwa nyenzo za ziada kwa makala haya, tafadhali tazama http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Hii ni makala ya ufikiaji wazi inayosambazwa chini ya masharti ya Leseni ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, ambayo inaruhusu matumizi, usambazaji na uzandikishaji katika njia yoyote, mradi tu matumizi ya mwisho si kwa faida ya kibiashara na msingi ni kwamba kazi ya awali ni sahihi. Marejeleo.
Kumbuka: Tunakuomba tu utoe anwani yako ya barua pepe ili mtu unayempendekeza kwenye ukurasa ajue kwamba unataka aone barua pepe hiyo na kwamba si barua taka. Hatutarekodi anwani zozote za barua pepe.
Swali hili linatumika kujaribu kama wewe ni mgeni na kuzuia uwasilishaji wa barua taka kiotomatiki.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellar JRussell. G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA huchangia katika kukandamiza kinga ya seli T na inawakilisha lengo linalowezekana la tiba ya kinga kwa ajili ya matibabu ya saratani ya binadamu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellar JRussell. G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA huchangia katika kukandamiza kinga ya seli T na inawakilisha lengo linalowezekana la tiba ya kinga kwa ajili ya matibabu ya saratani ya binadamu.
©2021 Chama cha Marekani cha Kuendeleza Sayansi. haki zote zimehifadhiwa. AAAS ni mshirika wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef na COUNTER. SayansiMaendeleo ISSN 2375-2548.