Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo kwa CSS. Kwa matumizi bora, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime hali ya utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Tofauti na wanyama wenye uti wa mgongo, wadudu hufikiriwa sana kuwa hawana homoni za steroidi za ngono zenye upendeleo wa kiume. Katika Anopheles gambiae, ecdysone steroid 20-hydroxyecdysone (20E) inaonekana kuwa imebadilika ili kudhibiti ukuaji wa mayai yanapotengenezwa na wanawake2 na kusababisha kipindi cha kutopatana wakati wa kuhamishwa kingono na wanaume3. Kwa kuwa ukuaji wa mayai na kuoana ni sifa muhimu za uzazi, kuelewa jinsi mbu wa kike wa Anopheles wanavyounganisha ishara hizi za homoni kunaweza kuwezesha muundo wa programu mpya za kudhibiti malaria. Hapa, tunafichua kwamba kazi hizi za uzazi zinadhibitiwa na steroidi tofauti za ngono kupitia mtandao tata wa vimeng'enya vinavyoamsha/kuzima ecdysteroid. Tulitambua ecdysone iliyooksidishwa maalum kwa wanaume, 3-dehydro-20E (3D20E), ambayo inalinda uzazi kwa kuzima upokeaji wa kijinsia wa wanawake kufuatia uhamisho wa kingono na uanzishaji kwa dephosphorylation. Ikumbukwe kwamba uhamisho wa 3D20E pia ulisababisha usemi wa jeni za uzazi zinazodumisha ukuaji wa mayai wakati wa maambukizi ya Plasmodium, kuhakikisha afya ya wanawake walioambukizwa. 20E inayotokana na wanawake haitoi mwitikio wa kijinsia, lakini huruhusu watu wanaooana kutaga mayai baada ya kinasi zinazozuia 20E kuzuiwa. Utambuzi wa homoni hii maalum ya steroidi ya wadudu wa kiume na jukumu lake katika kudhibiti upokeaji wa kijinsia wa wanawake, uzazi na mwingiliano na Plasmodium unaonyesha uwezekano wa kupunguza mafanikio ya uzazi wa mbu wanaosambaza malaria.
Visa na vifo vya malaria vinaongezeka tena4 kutokana na upinzani mkubwa wa wadudu katika mbu wa Anopheles, ambao ndio chanzo pekee cha vimelea vya malaria kwa binadamu. Biolojia ya upandikizaji wa mbu hawa ni shabaha inayovutia sana kwa hatua mpya za kudhibiti malaria kwa sababu mbu wa kike huoa mara moja tu5; kufanya tukio hili la upandikizaji mmoja kuwa tasa kungekuwa na uwezo mkubwa wa kupunguza idadi ya mbu shambani.
Wanawake hushindwa kufanya ngono baada ya kupokea homoni za steroid zenye kiwango cha juu kutoka kwa wanaume. Uchunguzi umeonyesha kuwa kichocheo cha ugumu katika kujamiiana zaidi ni 20-hydroxyecdysone (20E), homoni ya steroid inayojulikana zaidi kama mdhibiti wa mzunguko wa kuyeyuka katika hatua ya mabuu. Uwezo wa wanaume kutengeneza na kuhamisha 20E umebadilika haswa katika spishi za Anopheles ambazo ni sehemu ya Cellia7 ya jenasi ndogo, ambayo imeenea barani Afrika na inajumuisha vekta hatari zaidi za malaria, ikiwa ni pamoja na Anopheles gambiae. Hii ni muhimu sana kwa sababu katika spishi hizi wanawake pia hutoa 20E baada ya kila mlo wa damu, na 20E huendesha mzunguko wa oogenesis (tazama rejeleo 8). Hata hivyo, ni machache yanayojulikana kuhusu jinsi wanawake wanavyounganisha ishara kutoka vyanzo viwili tofauti vya ecdysone (uhamisho wa wanaume na uanzishaji wa kulisha damu) bila kuathiri uwezo wao wa kujamiiana. Kwa kweli, ikiwa 20E inayozalishwa na wanawake husababisha kutovumilia ngono, hii itasababisha utasa kwa watu wanaonyonyesha bikira, tabia ya kawaida sana kwa mbu hawa5.
Maelezo yanayowezekana ni kwamba madume wa A. gambiae huhamisha ecdysone maalum ya kiume iliyorekebishwa, ambayo huamsha mtiririko wa ishara katika njia ya uzazi ya mwanamke, na kusababisha kutokuwa na utulivu wa kujamiiana. Hata hivyo, ingawa wanyama wenye uti wa mgongo wana homoni nyingi za steroidi, kama vile estrojeni na androgen (iliyopitiwa katika marejeleo 9), kwa ufahamu wetu, steroidi zenye upendeleo wa androgen hazijatambuliwa kwa wadudu.
Tulianza kubaini mkusanyiko wa homoni za steroidi katika tezi ya nyongeza ya kiume ya kiume (MAG) ya A. gambiae iliyokomaa kingono tukitafuta steroidi zinazoweza kurekebisha. Kwa kutumia kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa juu pamoja na spektrometri ya wingi wa sanjari (HPLC-MS/MS) badala ya njia isiyo maalum sana iliyotumika hapo awali, tuligundua ecdysone (E) na 20E kwenye tishu hii, tukithibitisha matokeo ya awali. Hata hivyo, sampuli ilitawaliwa na steroidi za fosforasi zilizooksidishwa, sambamba na fomula ya 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Mchoro 1). Aina zingine ni pamoja na 3-dehydro-20E (3D20E) na 20E-22-phosphate (20E22P). Kiwango cha ishara cha HPLC-MS/MS cha 3D20E22P kilikuwa na viwango viwili vya ukubwa zaidi kuliko umbo lake la dephosphory, 3D20E, na viwango vitatu vya ukubwa zaidi kuliko ule wa E na 20E (Mchoro 1). Ingawa katika sehemu zingine za mwili na njia ya chini ya uzazi (LRT; Mchoro wa Data Iliyoongezwa 1a). Pia tulichambua ekdysteroids katika wanaume na wanawake waliofungwa hivi karibuni (chini ya siku 1) na kugundua 3D20E na 3D20E22P pekee katika MAG; E, 20E na 20E22P zilikuwepo katika jinsia zote mbili (Mchoro wa Data Iliyoongezwa 1b). Data hizi zinaonyesha kwamba wanaume wazima wa A. gambiae hutoa viwango vya juu vya homoni zinazorekebisha katika MAG zao ambazo hazijatengenezwa na wanawake.
MAG na LRT ya kike (ikiwa ni pamoja na atiria, vesicles za seminal, na parovarium) zilitolewa kutoka kwa wanaume bikira wenye umri wa siku 4 (wenye umri wa siku 4) na wanawake bikira na waliooana (0.5, 3, na 12 hpm). Ecdysone katika tishu hizi ilichambuliwa na HPLC-MS/MS (wastani ± sem; kipimo cha t kisicho na jozi, pande mbili, kiwango cha ugunduzi bandia (FDR) kilisahihishwa; NS, si muhimu; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: saa 3 dhidi ya saa 0.5, P = 0.035; saa 12 dhidi ya saa 3, P = 0.0015; saa 12 dhidi ya saa 0.5, P = 0.030. 3D20E22P: saa 3 dhidi ya saa 0.5, P = 0.25; saa 12 dhidi ya saa 3, P = 0.0032; Saa 12 dhidi ya saa 0.5, P = 0.015). Data zinatokana na nakala tatu za kibiolojia. Eneo la kilele kwa kila ecdysone linalovutia lilihesabiwa na kurekebishwa kwa idadi ya mbu. Ecdysone inawakilishwa na rangi kama ifuatavyo: E, kijani; 20E, chungwa; 20E22P, zambarau; 3D20E, bluu; 3D20E22P, waridi. Kipengee kilichopo ndani huongeza kipimo kwenye mhimili wa y ili kuonyesha viwango vya chini vya ecdysone.
Ili kuchunguza kama 3D20E22P na 3D20E huhamishwa wakati wa kujamiiana, tulichambua LRT za kike katika vipindi tofauti baada ya kujamiiana. Ingawa ecdysone haikupatikana kwa mabikira, tuliona kiasi kikubwa cha 3D20E22P katika LRT mara tu baada ya kujamiiana (saa 0.5 baada ya kujamiiana, hpm), ikipungua baada ya muda, huku viwango vya 3D20E vikiongezeka kwa kiasi kikubwa (Mchoro 1). Kwa kutumia 3D20E iliyosanifishwa na kemikali kama kiwango, tuliamua kwamba viwango vya homoni hii ya steroid katika LRT za kujamiiana vilikuwa vya juu zaidi ya mara 100 kuliko 20E (Jedwali la Data Iliyopanuliwa 1). Kwa hivyo, 3D20E22P ni ecdysone kuu ya kiume ambayo huhamishiwa kwa LRT ya kike wakati wa kujamiiana, na umbo lake la dephosphorylated, 3D20E, huwa nyingi sana muda mfupi baada ya kujamiiana. Hii inaonyesha jukumu muhimu kwa ecdysone ya mwisho katika biolojia ya baada ya kujamiiana ya kike.
Baada ya kutoa seti mpya ya data ya mpangilio wa RNA (RNA-seq) (Mchoro 2a), kwa kutumia bomba la bioinformatiki lililojengwa maalum, tulitafuta ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), na ecdysone inayosimba jeni la fosfati iliyobadilishwa 20E. EPP) inaonyeshwa katika tishu za uzazi. Tuligundua jeni moja la EPP linalotarajiwa na jeni mbili zinazowezekana za EcK (EcK1 na EcK2), lakini hatukuweza kupata jeni nzuri la EO linalotarajiwa. Ikumbukwe kwamba, jeni za EPP za kibinafsi zilionyeshwa katika viwango vya juu (asilimia 98.9) katika Gambia MAG lakini sio katika LRT za kike (Mchoro 2b), kinyume na matarajio yetu tangu dephosphorylation ya 3D20E22P ilitokea katika tishu hii ya kike. Kwa hivyo, tunaamini kwamba EPP ya kiume inaweza kuhamishwa wakati wa kujamiiana. Hakika, tulitumia lebo ya isotopu thabiti ya ndani ya mwili ili kufunika protini ya kike baada ya kujamiiana, kimeng'enya kilichotambuliwa na MS katika atiria ya kike (Mchoro 2c na Jedwali la Nyongeza 1). Uwepo wa EPP katika MAG na LRT ya kike iliyooanishwa (lakini si bikira) pia ulithibitishwa kwa kutumia kingamwili maalum (Mchoro 2d).
a, Bomba la bioinformatiki lililojengwa maalum ili kutafuta tishu za uzazi za kila jinsia kwa jeni zinazosimba EcKs, EOs, na EPPs. Nambari zilizo karibu na mishale zinaonyesha idadi ya wagombea wa kiume na wa kike katika kila hatua. Uchambuzi huu ulibainisha jeni moja la EPP (EPP) na jeni moja la EcK (EcK1) ambalo huonyeshwa kwa wanaume, na jeni moja la EcK (EcK2) ambalo huonyeshwa kwa jinsia zote mbili lakini halitoi jeni la EO linalopendekezwa.b, Ramani ya joto inayolinganisha usemi wa jeni linalopendekezwa katika bikira (V) na upandikizaji (M) Anopheles gambiae na Anopheles albicans tishu.Spca, utungishaji; MAGs, tezi za nyongeza kwa wanaume; Sehemu zingine za mwili, ikiwa ni pamoja na matiti, mabawa, miguu, miili yenye mafuta, na viungo vya ndani katika jinsia zote mbili, na ovari kwa wanawake. EcK2 inaonyeshwa sana katika MAG na atria ya Gambia, ilhali EPP inapatikana tu katika MAG.c, Uchambuzi wa Proteomiki wa uhamishaji wa kundi la ute wa kiume hadi atria ya kike kwa 3, 12 na 24 hpm, ikionyesha protini 67 zilizo nyingi zaidi. Wanawake walilelewa kwenye lishe yenye 15N ili kuweka lebo (na kufunika) protini zote. Wanaume wasio na lebo waliunganishwa na wanawake walio na lebo, na LRT za kike zilikatwa kwa 3, 12 na 24 hpm kwa uchambuzi wa proteomiki (tazama Jedwali la Ziada 1 kwa orodha kamili ya protini za ute wa kiume). Kipande kidogo, EPP, Eck1 na EcK2 ziligunduliwa katika MAG ya wanaume bikira kwa uchambuzi wa proteomiki wa tishu hizi.d, EPP iligunduliwa na western blot katika MAG na LRT ya wanawake bikira, lakini si kwa wanawake bikira au wanaume au wanawake wengine wote. mwili. Utando ulichunguzwa kwa wakati mmoja kwa kutumia anti-actin (kidhibiti upakiaji) na kingamwili za anti-EPP. Wanaume wote ni mabikira. Tazama Mchoro wa Nyongeza 1 kwa data ya chanzo cha jeli. Vidonge vya Magharibi vilifanywa mara mbili na matokeo sawa.
Shughuli ya ekdysteroid phosphofosfati ya EPP ilithibitishwa baada ya kupevuka na HPLC-MS/MS kwa 3D20E22P iliyotengwa kutoka MAG (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 2a). Zaidi ya hayo, tuliponyamazisha EPP kwa kuingiliwa na RNA (RNAi), tuligundua kupungua kwa nguvu kwa shughuli ya fosfati katika tishu za uzazi za madume hawa (Mchoro 3a), na wanawake waliopandishwa na madume walionyamazishwa na EPP walionyesha kiwango kikubwa cha 3D20E iliyoondolewa fosfati (Mchoro 3b) licha ya kunyamazishwa kwa jeni kwa sehemu (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 2b,c). Kwa upande mwingine, hatukugundua mabadiliko makubwa katika uwiano wa 20E22P/20E katika mbu wale wale, ambayo inaweza kupendekeza kwamba kimeng'enya hicho ni maalum kwa 3D20E22P (Mchoro 3b).
a, Kupungua kwa shughuli ya fosfati katika MAG kunakosababishwa na kunyamazisha kwa EPP kwa kutumia vidhibiti vya EPP RNA (dsEPP) yenye nyuzi mbili au GFP RNA (dsGFP) yenye nyuzi mbili. Mabwawa ishirini ya MAG yalitumika katika kila nakala (P = 0.0046, jaribio la t lililounganishwa, pande mbili), linalowakilishwa na nukta tofauti.b, Wanawake waliooana na wanaume walionyamazishwa na EPP walikuwa na uwiano mdogo sana wa 3D20E iliyoondolewa fosforasi kwa 3 hpm (P = 0.0043, jaribio la t lisilounganishwa, pande mbili), ilhali viwango vya 20E havikuathiriwa (P = 0.063, bila kuunganishwa). jaribio la t, lenye pande mbili). Data zinawasilishwa kama wastani ± sem kutoka kwa mabwawa matatu ya wanawake 13, 16 na 19 kila mmoja. c, Wanawake waliojamiiana na wanaume walionyamazishwa na EPP walikuwa na viwango vya juu zaidi vya kujamiiana tena (P = 0.0002, jaribio halisi la Fisher, lenye pande mbili). Wanawake walilazimishwa kwanza kujamiiana ili kuhakikisha hali yao ya kujamiiana; Siku 2 baadaye, waliwasiliana na wanaume wengine waliokuwa wamebeba mbegu za kiume zilizobadilishwa vinasaba ili kutathmini viwango vya kujamiiana tena kwa kugundua kwa kiasi kikubwa PCR ya transgene.d, wanawake waliolishwa damu waliojamiiana na wanaume walionyamazishwa na EPP walikuwa na uzazi uliopungua kwa kiasi kikubwa (P < 0.0001; kipimo cha Mann-Whitney, pande mbili) na idadi ya yai iliyopunguzwa kidogo (P = 0.088, kipimo cha Mann-Whitney, pande mbili), huku kiwango cha kuzaa hakikuathiriwa (P = 0.94, kipimo halisi cha Fisher, pande mbili).Katika paneli zote, n inawakilisha idadi ya sampuli za mbu huru kibiolojia.NS, si muhimu.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Kisha, tulitathmini kama ecdysone dephosphorylation ni muhimu kwa kusababisha upinzani wa kujamiiana kwa wanawake. Ikumbukwe kwamba, wanawake waliojamiiana na wanaume waliopungua EPP walijamiiana tena kwa masafa ya juu zaidi (44.9%) kuliko wanawake wa kudhibiti (10.4%) walipokutana na wanaume wengine (waliobadilishwa maumbile) (Mchoro 3c). Pia tuliona kupungua kwa kiasi kikubwa kwa uzazi (Mchoro 3d, kushoto) na kupungua kidogo kwa idadi ya mayai yaliyotagwa na wanawake hawa (Mchoro 3d, katikati), huku asilimia ya mayai yaliyotagwa na wanawake (mwitikio mwingine uliotokana na wanawake kwa kujamiiana )) haikuathiriwa (Mchoro 3d, kulia). Kwa kuzingatia umaalumu ulioonekana wa EPP kwa 3D20E22P, matokeo haya yanaonyesha kwamba uanzishaji wa 3D20E na EPP iliyohamishwa wakati wa kujamiiana inaweza kuwa na jukumu muhimu katika kuzima upokeaji wa kike kwa kujamiiana zaidi, tabia ambayo hapo awali ilihusishwa na uhamisho wa kingono wa 20E. Kwa hivyo, homoni hii maalum ya kiume pia huathiri sana uzazi wa kike.
Kisha, tulilinganisha shughuli za 20E na 3D20E katika majaribio ya sindano kwa mabikira waliokomaa kingono kwa kutumia 3D20E iliyotengenezwa kwa kemikali (Mchoro 4a–c) na 20E inayopatikana kibiashara. Tuliona kuwa 3D20E ilikuwa na ufanisi zaidi kuliko 20E katika kuzuia unyeti wa kike kwa kujamiiana katika viwango vyote viwili (Mchoro 4d). Ikumbukwe kwamba nusu ya kiwango cha kisaikolojia cha 3D20E katika LRT (ukubwa 1,066 baada ya sindano dhidi ya udogo 2,022 baada ya kujamiiana) ilisababisha idadi ya wanawake wasio na kinga ambayo ilikuwa juu mara 20 kuliko kiwango cha kisaikolojia cha 20E (ukubwa 361 baada ya sindano) masaa 24 baada ya sindano katika mkusanyiko wa juu zaidi wa udogo 18 baada ya kujamiiana; Jedwali la Data Iliyoongezwa 1). Matokeo haya yanaendana na wazo kwamba uhamisho wa kijinsia wa 20E hausababishi vipindi vya kukataa kujamiiana, na zaidi ya hayo yanaelekeza kwa 3D20E kama sababu kuu katika kuhakikisha uhusiano wa mzazi na mtoto. 3D20E pia ilikuwa na shughuli nyingi zaidi kuliko 20E katika majaribio ya kutaga mayai kwa wanawake bikira (Mchoro 4e), ikidokeza kwamba kiwango cha kawaida cha kutaga mayai tulichokiona baada ya kunyamazishwa kwa EPP kwa sehemu kilitokana na uwepo wa shughuli iliyobaki ya 3D20E ambayo bado inazalishwa na sababu za kike zinazosababishwa na kujamiiana.
(a,b) 3D20E iliyotengenezwa kwa kemikali kutoka 20E (a) yenye ubadilishaji/ufanisi wa juu sana (data inayowasilishwa kama wastani ± nusu kutoka kwa athari tatu huru za usanisi) (b).c, Wigo wa Misa (nusu ya chini) inalingana kabisa na ecdysone inayopatikana katika LRT ya kike iliyounganishwa (nusu ya juu).d, Ikilinganishwa na 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Jaribio halisi la Fisher, lenye pande mbili) na ethanoli 10% (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Jaribio halisi la Fisher, lenye pande mbili), huku 20E ikiwa juu zaidi kuliko udhibiti pekee kwa dozi za juu (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Jaribio halisi la Fisher, 2-upande).e, sindano ya 3D20E ilisababisha viwango vya juu zaidi vya kuzaa kwa mbu jike bikira kuliko vidhibiti 10% vya ethanoli (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Jaribio halisi la Fisher, pande mbili), huku 20E ikilinganishwa na vidhibiti kwa vipimo vya juu pekee (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Jaribio halisi la Fisher, pande mbili).3D20E ilisababisha viwango vya juu zaidi vya kuzaa kuliko 20E kwa vipimo vya juu zaidi (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Jaribio halisi la Fisher, pande mbili).Katika paneli zote, n inawakilisha idadi ya sampuli za mbu huru kibiolojia.NS, si muhimu.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Data ni kutoka kwa nakala tatu.
Katika tafiti zilizopita, tuligundua kuwa uhamisho wa homoni za steroidi husababisha usemi wa MISO (Kichocheo Kinachosababishwa na Kujamiiana cha Oogenesis 11), jeni la uzazi la kike linalolinda wanawake wa A. gambiae kutokana na maambukizi ya P. falciparum. Gharama za kiafya zinazosababishwa na 13, vimelea hatari zaidi vya malaria kwa binadamu. Kwa kuzingatia umuhimu wa MISO kwa utimamu wa uzazi wa Anopheles katika maeneo yaliyoenea sana ya malaria, tuliamua kubaini ni homoni gani ya 3D20E au 20E inayosababisha usemi wa jeni hili. Tuligundua kuwa ingawa sindano ya 20E ilisababisha vipokezi vya homoni za nyuklia (HR) mahususi au kwa nguvu zaidi, kama vile HR3 na HR4, na shabaha za kawaida za steroidi za chini, kama vile jeni za yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO ilisababishwa kwa nguvu zaidi na 3D20E (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 3). Kwa hivyo, uhamisho wa kijinsia wa homoni hii ya steroidi ya androgenic unaonekana kusababisha mifumo inayowalinda wanawake kutokana na gharama zinazosababishwa na maambukizi ya vimelea. Zaidi ya hayo, 3D20E huathiri tofauti isoforms zote mbili za Kipokezi cha E EcR, kinachoshawishi EcR-A na kukandamiza EcR-B, na kuchochea kwa nguvu zaidi jeni zingine zinazochochea kujamiiana, ikiwa ni pamoja na HPX15, ambayo huathiri uzazi wa kike. Hii inaweza kuelezea utasa mkubwa unaoonekana kwa wanawake waliojamiiana na wanaume walionyamazishwa na EPP (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 3). Data hizi zinaonyesha kuwepo kwa njia za chini zinazoamilishwa kwa upendeleo na homoni mbili za ecdysone ambazo zinaweza kusababisha utendaji kazi maalum wa kijinsia.
Kisha, tulijaribu utendaji kazi wa jeni mbili za EcK zilizotambuliwa katika bomba letu la bioinformatiki. Kunyamazisha EcK1 au EcK2 kulisababisha vifo vikubwa kwa wanaume (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 4a), ikidokeza kwamba fosforasi ya ecdysone, na hivyo kuizima, ni muhimu kwa kuishi. Kwa sababu EcK2 ilionyeshwa kwa viwango vya juu kuliko EcK1 na iligunduliwa katika MAG na proteomics (Mchoro 2b,c na Jedwali la Ziada 2), tulithibitisha shughuli yake ya kinase ya ecdysteroid kwa kuiingiza kwenye 20E, ambayo ilisababisha fosforasi 20E22P (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 2).4b). Tulipokuwa tukitumia 3D20E kama substrate, hatukuweza kugundua bidhaa ya fosforasi 3D20E22P (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 4c), ikidokeza kwamba 20E badala ya 3D20E inaweza kuwa shabaha inayopendelewa ya EcK2.
Kulingana na uchambuzi wetu wa RNA-seq, EcK2 pia ilionyeshwa sana katika LRT ya wanawake bikira, ambapo ilizimwa baada ya kujamiiana (Mchoro 2b). Tulithibitisha data hizi na kubaini kuwa usemi wa EcK2 haukuathiriwa na kunyonyeshwa kwa damu (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 5a). Tukipanua majaribio yetu ya awali ya MS, tuligundua kuwa kilele cha 20E22P kilihusiana kwa karibu na kilele cha 20E (saa 22-26 baada ya mlo wa damu; Mchoro wa Data Uliopanuliwa 5b). Kunyamazishwa kwa EcK2 kwa wanawake bikira kulisababisha ongezeko la mara 3 la uwiano wa 20E hadi 20E22P saa 26 baada ya mlo wa damu (Michoro ya Data Uliopanuliwa 2c na 5c), ikithibitisha kwamba EcK2 pia ina fosforasi 20E kwa wanawake. Ikumbukwe kwamba, mabikira waliopungua EcK2 walidumisha upokeaji kamili wa ngono (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 5d,e), ikidokeza zaidi kwamba uzalishaji wa wanawake wa 20E hausababishi kukataa kujamiiana. hedhi.Hata hivyo, wanawake hawa walikuwa na viwango vya juu vya kutaga mayai ikilinganishwa na vidhibiti, huku zaidi ya 30% ya mabikira wanaotaga mayai (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 5f).Ikiwa sindano mbili za Eck2 RNA (dsEcK2) zilizopigwa nyuzi mbili zilifanywa baada ya kunyonyeshwa damu, kutaga hakukutokea, ambapo kilele cha 20E kutokana na kumeza damu kilikuwa kimepungua.Kwa ujumla, matokeo haya yanaunga mkono mfumo ambao 20E ilitoa baada ya kunyonya damu inaweza kusababisha kutaga, lakini tu wakati kizuizi cha kutaga mayai (EcK2 na pengine mambo mengine) kinazimwa kwa kuoana.Sindano za 20E wala 3D20E hazikuzuia usemi wa EcK2 kwa mabikira (Mchoro wa Data Uliopanuliwa 5g), zikidokeza kwamba mambo mengine yanachangia kizuizi cha kinase hii.Hata hivyo, viwango vya 20E baada ya kunyonyeshwa damu havikutosha kusababisha usumbufu wa kutaga mayai, lakini vilisababishwa vyema na viwango vya juu vya 3D20E iliyohamishwa kingono.
Matokeo yetu yanatoa ufahamu muhimu kuhusu mifumo inayodhibiti mafanikio ya uzazi ya A. gambiae. Mfano umeibuka ambapo wanaume wamebadilika ili kutengeneza viwango vya juu vya 3D20E, ecdysone iliyorekebishwa mahususi kwa wanaume ambayo inahakikisha uzazi kwa kupunguza hisia za wanawake ili waweze kuoana zaidi. Wakati huo huo, vekta hizi za malaria pia zimeunda mfumo mzuri wa kuamsha 3D20E kwa wanawake ili kukabiliana na uhamisho wa kijinsia wa EPP mahususi kwa wanaume. Kwa ufahamu wetu, huu ni mfano wa kwanza wa mfumo wa homoni za steroidi unaotawaliwa na wanaume na wanawake unaofanya kazi ya kipekee na muhimu kwa wadudu. Utendaji wa ecdysone mahususi kwa wanaume umedhaniwa lakini haujaonyeshwa kwa uhakika. Kwa mfano, dhana iliyokanushwa kwa kiasi kikubwa 18 ni kwamba kazi hizi zinaweza kufanywa na mtangulizi wa 20E E1. Inajulikana sana kwamba katika Drosophila, monandry husababishwa na uhamisho wa kijinsia wa peptidi ndogo za ngono19,20 ambazo huingiliana na niuroni zinazohifadhi njia ya uzazi ya mwanamke kupitia vipokezi maalum vya peptidi za ngono21,22. Kazi zaidi inahitajika ili kubaini mkondo wa chini. mtiririko wa ishara unaodhibitiwa na 3D20E kwa jike wa A. gambiae na kubaini kama mtiririko huu unaweza kuhifadhiwa kati ya mbu na Drosophila.
Kwa kuzingatia jukumu muhimu la 3D20E katika uzazi na tabia za wanawake zilizotambuliwa katika utafiti wetu, njia zinazoongoza kwa usanisi na uanzishaji wa 3D20E hutoa fursa mpya kwa mikakati ya udhibiti wa mbu ya baadaye, kama vile uzalishaji wa dume tasa zenye ushindani katika mikakati ya teknolojia ya wadudu tasa. Tumia kwa ajili ya kutolewa porini au kuiga 3D20E katika mchezo wa bikira. Kazi mahususi ya 3D20E kwa wanaume inaweza kuwa ilibadilika wakati A. gambiae na spishi zingine za Cellia zilipopata uwezo wa kuganda shahawa zao kwenye viziba vya kujamiiana, kwani hii inaruhusu uhamishaji mzuri wa idadi kubwa ya homoni na vimeng'enya vinavyoamsha homoni. Kwa upande mwingine, mageuzi ya 3D20E yanayotekeleza monandry hutoa utaratibu kwa wanawake (kupitia usemi mwingi wa MISO) kupendelea utimamu wao wa uzazi katika maeneo yenye kiwango kikubwa cha malaria, ambayo kwa njia isiyo ya moja kwa moja huchangia maambukizi ya Plasmodium. Kwa kuzingatia kwamba 20E ya wanawake imeonyeshwa kuwa na athari kubwa katika uhai na ukuaji wa P. falciparum katika mbu wa kike wa Anopheles,24 njia za homoni za steroidi za kiume na kike sasa ni vipengele muhimu vya mwingiliano wa mbu na vimelea.
Aina za A. gambiae G3 zilikuzwa chini ya hali ya kawaida ya wadudu (26-28 °C, unyevu wa jamaa wa 65-80%, kipindi cha mwanga/giza cha saa 12:12). Mabuu walilishwa chakula cha samaki cha unga (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets na Tetra Pond Sticks kwa uwiano wa 7:7:2). Mbu wazima walilishwa kwa mchanganyiko wa dextrose 10% na damu ya binadamu ya kila wiki (vipengele vya damu vya utafiti). Mbu bikira walipatikana kwa kutenganisha jinsia katika hatua ya pupal baada ya kuchunguza ncha kwa hadubini. Madume waliobeba DsRed transgene wameelezwa hapo awali.
Majaribio ya kulazimishwa kujamiiana yalifanywa kulingana na itifaki zilizoelezwa hapo awali. Kwa kujamiiana kwa asili, wanawake bikira wa siku 4 waliwekwa katika uwiano wa 1:3 na wanaume bikira waliokomaa kingono kwa usiku mbili. Kwa majaribio ambapo wanaume walidungwa sindano ya dsEPP, kufunga pamoja kuliambatana na siku 3-4 baada ya sindano, wakati shughuli ya fosfati ilizimwa kwa kiwango cha juu zaidi (Mchoro wa Data Uliopanuliwa. 2b).
Tishu za mbu, maiti zilizobaki (mwili uliobaki), au mwili mzima ziligawanywa katika methanoli 100% na kuunganishwa kwa kutumia beader (shanga za glasi 2 mm, 2,400 rpm, sekunde 90). Kiasi cha tishu na ujazo wa methanoli vilikuwa kama ifuatavyo: mwili uliobaki, 50 katika µl 1,000; MAG, 50–100 µl 80; LRT ya kike, 25–50 80 µl. Mtiririko ulifanyiwa uchimbaji wa pili wa methanoli kwa ujazo sawa wa methanoli. Uchafu wa seli uliondolewa kwa kuzungusha. Methanoli kutoka kwa uchimbaji wote wawili iliunganishwa na kukaushwa chini ya mtiririko wa nitrojeni, kisha ikasimamishwa tena katika ujazo ufuatao wa 80% methanoli katika maji: mwili uliobaki, 50 µl; MAG na LRT ya kike, 30 µl.
Sampuli zilichambuliwa kwenye spectromita ya wingi (ID-X, Thermo Fisher) iliyounganishwa na kifaa cha LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl ya sampuli ilidungwa kwenye safu wima ya 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) iliyodumishwa kwenye 25 °C. Awamu zinazosogea za LC zilikuwa A (maji, 0.1% asidi ya fomu) na B (acetonitrile, 0.1% asidi ya fomu). Mteremko wa LC ulikuwa kama ifuatavyo: 5% B kwa dakika 1, kisha ikaongezeka hadi 100% B kwa dakika 11. Baada ya dakika 8 kwa 100%, sawazisha safu wima tena kwa 5% B kwa dakika 4. Kiwango cha mtiririko kilikuwa 0.3 ml min-1. Ioni katika chanzo cha MS hukamilishwa na ioni ya umeme iliyopashwa joto katika hali chanya na hasi.
Kipima uzito hupima data katika safu ya m/z kuanzia 350 hadi 680 kwa azimio 60,000 katika hali kamili ya MS. Data ya MS/MS ilipatikana kwenye [M + H]+ (malengo yote), [M - H2O + H]+ (malengo yote), na [M - H]- (malengo yenye fosforasi). Data ya MS/MS ilitumika kuthibitisha sifa za ecdysone za malengo ambayo hakuna kiwango kilichopatikana. Ili kutambua ecdysteroids zisizolengwa, data ya MS/MS kwa vilele vyote vya HPLC vyenye wingi wa zaidi ya 15% ilichambuliwa. Pima kwa kutumia mikunjo ya kawaida iliyoundwa kutoka kwa viwango safi (20E, 3D20E) ili kuhesabu kiasi kamili au upunguzaji wa sampuli moja maalum (malengo mengine yote) ili kuhesabu usawa wao na kiasi kilichopatikana katika dume mmoja. Kwa 3D20E, upimaji ulifanywa kwa kutumia jumla ya viambato vifuatavyo: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Data zilitolewa na kupimwa kwa kutumia Kifuatiliaji (toleo la 4.1). Data ya MS/MS ilichambuliwa kwa kutumia Xcalibur (toleo la 4.4). Spektra ya MS ya E, 20E na 3D20E zililinganishwa na viwango husika. 3D20E22P ilichambuliwa kwa kutumia kitendanishi cha Girard. 20E22P ilichambuliwa kwa uwiano wa m/z.
3D20E22P ilisafishwa kutoka kwa MAG. Utakaso ulifanywa kwa kiwango cha uchambuzi kwa kutumia kromatografi ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu (Acquity, Waters) kwa kutumia kigunduzi chenye msingi wa wingi wa nne (QDa, Acquity, Waters) chini ya hali sawa za LC kama uchambuzi wa HPLC-MS/MS. Mkusanyiko wa sehemu ulianzishwa wakati m/z inayolingana na 3D20E22P iligunduliwa kwa wakati uleule wa uhifadhi kama ilivyoamuliwa hapo awali. Usafi wa misombo iliyotolewa uliangaliwa na HPLC-MS/MS kama ilivyoelezwa hapo juu.
Jumla ya RNA ilitolewa kutoka kwa tishu 10-12 za uzazi au sehemu zingine za mwili (zisizo na kichwa) kwa kutumia kitendanishi cha TRI (Thermo Fisher) kwa kufuata maagizo ya mtengenezaji. RNA ilitibiwa na TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA ilitengenezwa kwa kutumia Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) kwa kufuata maagizo ya mtengenezaji. Vipimo vya awali vya unukuzi wa nyuma PCR kiasi (RT-qPCR; Jedwali la Data Iliyoongezwa 2) vilichapishwa hapo awali24 au vilibuniwa kwa kutumia Primer-BLAST26, huku upendeleo ukitolewa kwa bidhaa zenye ukubwa wa bp 70-150 na zinazoenea kwenye makutano ya exon-exon au primers za jozi ya Primer tofauti za exons. cDNA sampuli kutoka kwa nakala tatu hadi nne za kibiolojia zilipunguzwa mara nne katika maji kwa RT-qPCR. Upimaji ulifanywa katika athari za kurudia 15 µl zenye 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), vipimo vya awali, na 5 µl ya cDNA iliyopunguzwa. Athari ziliendeshwa kwenye Mfumo wa PCR wa muda halisi wa QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) na data zilikusanywa na kuchanganuliwa kwa kutumia Ubunifu na Uchambuzi (toleo la 2.4.3). Kama ilivyoonyeshwa katika utafiti huu, kiasi kinachohusiana kilirekebishwa kwa jeni la ribosomal RpL19 (AGAP004422), ambalo usemi wake haukubadilika sana na ulaji wa damu 27 au ule wa kujamiiana 3.
Ubora wa RNA ulichunguzwa kwa kutumia Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Maktaba za Illumina zenye ncha mbili ziliandaliwa na kuendeshwa katika Taasisi ya Broad ya MIT na Harvard. Usomaji wa mfuatano ulilinganishwa na jenomu ya A. gambiae (aina ya PEST, toleo la 4.12) kwa kutumia HISAT2 (toleo la 2.0.5) na vigezo chaguo-msingi. Usomaji wenye alama za ubora wa ramani (MAPQ) <30 uliondolewa kwa kutumia Samtools (toleo la 1.3.1). Idadi ya usomaji uliounganishwa na jeni ilihesabiwa kwa kutumia htseq-count (toleo la 0.9.1) na vigezo chaguo-msingi. Usomaji wa kawaida ulihesabiwa na usemi tofauti wa jeni ulichambuliwa kwa kutumia kifurushi cha DESeq2 (toleo la 1.28.1) katika R (toleo la 4.0.3).
Wagombea wa jeni wanaorekebisha Ecdysone walitambuliwa kwa kutafuta kwanza jenomu ya A. gambiae kwa kutumia algoriti ya PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), kwa kutumia thamani chaguo-msingi Vigezo vyenye mfuatano wa protini ya hoja ufuatao: kutoka Bombyx mori (Nambari ya Upatanisho. NP_001038956.1), Musca domestica (Nambari ya Upatanisho. XP_005182020.1, XP_005175332.1 na XP_011294434.1) na Microplitis demolitor (Nambari ya Upatanisho. XP_008552646.1 na XP_008552645.1) EcK kutoka B. mori (Nambari ya Upatanisho. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Nambari ya Upatanisho. NP_651202), Apis mellifera (Nambari ya Upatanisho XP_394838) na Acyrthosiphon pisum (Nambari ya Upatanisho XP_001947166); na EPP kutoka B. mori (Nambari ya Upatanisho XP_001947166) NP_001177919.1 na NP_001243996.1) na EO ya D. melanogaster (Nambari ya Upatanisho NP_572986.1) (hatua ya 1). Ifuatayo, kichujio hupiga kulingana na usemi wa juu wa mRNA (vipande >100/ekoni za kilobase kwa kila milioni ya usomaji uliopangwa (FPKM) au >85%) katika tishu za uzazi (LRT ya kike au MAG) nchini Gambia (hatua ya 2). Ili kuboresha umaalum, tulichagua vimeng'enya vinavyohitajika ambavyo pia huonyeshwa katika tishu za uzazi za A. albimanus, spishi ya anopheles ambayo haisababishi au kuhamisha ecdysone wakati wa kujamiiana. Jeni zinazohitajika zilichujwa kulingana na usemi mdogo (<100 FPKM au
Majike mabikira wenye umri wa siku 4-6 wenye umri wa siku 15-walio na lebo ya N walilazimishwa kujamiiana na dume bikira wasio na lebo wenye umri unaolingana. Kujamiiana kwa mafanikio kulithibitishwa kwa kugundua plagi za kujamiiana chini ya hadubini ya epifluorescence. Katika 3, 12, na 24 hpm, atria ya jike 45-55 waliojamiiana ilikatwakatwa katika 50 µl ya amonia bikaboneti buffer (pH 7.8) na kuwekwa sawa kwa mchi. Homogenati iliwekwa katikati na supernatant ikachanganywa na 50 µl ya 0.1% RapiGest (186001860, Waters) katika 50 mM ammonium bikaboneti. Supernatant na chembe kutoka kwa kila sampuli viligandishwa kwenye barafu kavu na kusafirishwa usiku kucha hadi maabara ya MacCoss katika Chuo Kikuu cha Washington, ambapo maandalizi ya sampuli ya LC-MS/MS yalikamilishwa. Rudisha chembe katika 50 µl ya 0.1% RapiGest katika 50 mM. Bikabonati ya amonia na sonicate katika umwagaji wa maji. Kiwango cha protini cha pellet na supernatant kilipimwa kwa kipimo cha BCA, sampuli zilipunguzwa kwa kutumia dithiothreitol ya mM 5 (DTT; Sigma), iliyochanganywa na iodoacetamide ya mM 15 (Sigma) na kuangushwa kwa joto la 37 °C (1:0 50) kwa saa 1 kwa kutumia trypsinization: uwiano wa trypsin: substrate). RapiGest ilichujwa kwa kuongezwa kwa 200 mM HCl, ikifuatiwa na kuangushwa kwa joto la 37 °C kwa dakika 45 na kuzungushwa kwa kasi ya 14,000 rpm kwa dakika 10 kwa joto la 4 °C ili kuondoa uchafu. Sampuli zilioshwa kwa kutumia uchimbaji wa awamu-ngumu wa aina mbili (Oasis MCX cartridges, Waters) na kusimamishwa tena katika asidi fomik ya 0.1% kwa mkusanyiko wa mwisho wa protini wa 0.33 µg µl-1. Proteome za MAG ambazo hazijaandikwa zilichambuliwa vile vile kutoka kwa bikira. wanaume. Nakala mbili za uchambuzi zilichambuliwa kwa kila sampuli. Kisha, µg 1 ya kila moja ilichambuliwa kwa kutumia safu wima ya silika iliyochanganywa ya sentimita 25 yenye urefu wa 75-μm yenye mtego wa silika iliyochanganywa ya sentimita 4 Kasil1 (PQ) iliyojaa resini ya awamu iliyogeuzwa ya Jupiter C12 (Phenomenex) na kromatografia ya kioevu ya dakika 180. Mchanganuo wa sampuli - MS/MS iliendeshwa kwenye spektromita ya wingi ya Q-Exactive HF (Thermo Fisher) yenye Mfumo wa nanoACQUITY UPLC (Waters). Data inayohusiana na upatikanaji wa data iliyotengenezwa kwa kila utendakazi ilibadilishwa kuwa umbizo la mzML kwa kutumia Proteowizard (toleo la 3.0.20287) na kwa kutumia Comet31 (toleo la 3.2) dhidi ya hifadhidata ya FASTA iliyo na mfuatano wa protini kutoka Anopheles gambiae (VectorBase toleo la 54), Anopheles coluzzi Utafutaji ulifanywa kwenye Mali-NIH (VectorBase toleo la 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Machi 2021), A. gambiae RNA-seq, na tafsiri za fremu tatu za uchafuzi unaojulikana wa binadamu. FDR zinazolingana na ramani ya peptide ziliamuliwa kwa kutumia Percolator32 (toleo la 3.05) zenye kizingiti cha 0.01, na peptidi zilikusanywa katika vitambulisho vya protini kwa kutumia protini parsimony katika Limelight33 (toleo la 2.2.0). Wingi wa protini ulikadiriwa kwa kutumia kipengele cha wingi wa spektrali (NSAF) kilichohesabiwa kwa kila protini katika kila kipindi kama ilivyoelezwa hapo awali. NSAF ikilinganishwa na kila protini ilipimwa kwa wastani katika sampuli kutoka kwa nakala mbili tofauti za kibiolojia. Uwekaji lebo wa 15N ulifanikiwa kufunika proteome ya kike, ingawa kiasi kidogo cha protini isiyo na lebo kingeweza kugunduliwa kutoka kwa mabikira walio na lebo. Tulirekodi ugunduzi wa kupungua kwa protini ya kiume (spektramu 1-5) katika sampuli mbichi za kike pekee katika kipindi cha kiufundi, ambapo sampuli mbichi zilipimwa baada ya sampuli za kiume/kuoana, kutokana na HPLC "kuendelea". Protini za mara kwa mara zilizopatikana kama 'uchafu' kutoka kwa mabikira walio na lebo zimeorodheshwa katika Jedwali la Nyongeza 1.
Peptidi mbili za antijeni, QTTDRVAPAPDQQQ (ndani ya isotype PA) na MESGTTTPSGDSEQ (ndani ya isotype PA na PB) katika Genscript. Peptidi hizo mbili ziliunganishwa, kisha zikaunganishwa na protini ya kubeba KLH na kudungwa ndani ya sungura wa New Zealand. Sungura walitolewa kafara baada ya sindano ya nne, na IgG yote ilitengwa kwa utakaso wa affinity. IgG kutoka kwa sungura mahususi zaidi wa EPP ilitumika kwa ajili ya kufifisha zaidi magharibi.
Kwa bloti za magharibi, MAG (n = 10, ambapo n inawakilisha idadi ya sampuli za mbu zisizojitegemea kibiolojia) na LRT ya kike (n = 30) kutoka kwa wanaume bikira wenye umri wa siku 4 na wanawake bikira au waliolazimishwa (<10 baada ya kujamiiana), bafa ya uchimbaji wa protini (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodiamu deoksikolate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × cocktail ya kuzuia protease inhibitor (Roche)) iliongezwa kando. Sampuli zilibadilishwa kuwa homogeneous mara moja baada ya kukatwa kwa kutumia beader (shanga za glasi 2 mm, 2,400 rpm, sekunde 90). Uchafu usioyeyuka uliondolewa kwa kuzungusha kwa 20,000 g kwa 4 °C. Protini zilipimwa kwa kutumia jaribio la Bradford (Bio-Rad). Kisha, 20 µg ya protini ya MAG, 40 µg ya protini ya LRT, na 20 µg ya protini ya wingi iliyobaki. ziliondolewa na kutengwa na 10% Bis-Tris NuPAGE kwa kutumia bafa ya MOPS. Protini zilihamishiwa kwenye utando wa floridi ya polyvinylidene kwa kutumia mfumo wa uhamisho wa iBlot2 (Thermo Fisher). Utando ulioshwa mara mbili katika 1× PBS-T (0.1% Tween-20 katika PBS) na kisha kuzuiwa katika bafa ya kuzuia Odyssey (Li-Cor) kwa saa 1 kwa 22°C. Utando ulitikiswa usiku kucha kwa 4°C kwa kutumia kingamwili ya msingi ya sungura anti-EPP polyclonal (1:700 katika bafa ya kuzuia) na kingamwili ya msingi ya monoclonal anti-actin panya MAC237 (Abeam; 1:4,000). Utando ulioshwa na PBS-T na kisha kuingizwa na kingamwili za pili (punda anti-sungura 800CW na mbuzi anti-panya 680LT (Li-Cor), zote 1:20,000) katika bafa ya kuzuia yenye 0.01% SDS na 0.2% Tween -20 kwa saa 1 kwa joto la 22 °C. Utando ulioshwa na PBS-T na kupigwa picha kwa kutumia kichanganuzi cha Odyssey CLx. Picha zilikusanywa na kusindika katika Image Studio (toleo la 5.2). Bendi maalum inayolingana na isoform ya EPP-RA (82 kDa) haikugunduliwa.
Maeneo ya usimbaji wa EPP (kama isoform AGAP002463-RB yenye kikoa cha histidine fosfati, utafutaji wa kikoa kilichohifadhiwa cha NCBI 34) na EcK2 (AGAP002181) yaliunganishwa katika pET-21a(+) plasmidi (Novagen Millipore Sigma); Vipuli vya awali vimeorodheshwa katika Jedwali la Data Iliyoongezwa 2. Viunganishi vinane vya GS4 (vilivyo sanjari) viliingizwa kabla ya lebo ya C-terminal 6xHis ya muundo wa pET-21a(+)-EcK2. Protini zinazounganishwa zilizalishwa kwa kutumia mmenyuko wa usanisi wa protini ya E. coli isiyo na seli ya NEBEExpress (New England BioLabs). Protini zinazounganishwa zilisafishwa kwa kutumia nguzo za mzunguko wa NEBexpress Ni (New England BioLabs). Protini ya kudhibiti Dihydrofolate reductase (DHFR) ilizalishwa kwa kutumia kiolezo cha DNA kutoka kwa Kifaa cha Usanisi wa Protini ya E. coli Isiyo na Seli ya NEBEExpress. Protini zilihifadhiwa katika glycerol 50% katika PBS kwa -20 °C kwa hadi miezi 3.
Shughuli ya fosfati ya EPP na dondoo za tishu ilipimwa kwa kutumia fosfeti ya nitrofenili 4 (pNPP; Sigma-Aldrich). Kizuizi cha mmenyuko kilikuwa na Tris 25 mM, asidi asetiki 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0.1 mM, na DTT 1 mM. Tishu ilibadilishwa kuwa sare katika kizuizi cha mmenyuko na uchafu wa seli uliondolewa kwa kuzungusha. Anzisha mmenyuko kwa kuongeza kimeng'enya au dondoo la tishu kwenye kizuizi cha mmenyuko kilicho na 2.5 mg ml-1 pNPP. Mchanganyiko wa mmenyuko uliwekwa kwenye joto la kawaida gizani, na kiasi cha pNP kilichobadilishwa kutoka pNPP kilipimwa kwa kupima unyonyaji kwa 405 nm kwa nyakati tofauti.
Kwa shughuli ya EcK ndani ya vitro, protini iliwekwa kwenye incubator na 0.2 mg 20E au 3D20E katika bafa ya 200 µl (pH 7.5) iliyo na 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP na 10 mM MgCl2 kwa saa 2 kwa 27 °C. Mwitikio ulisimamishwa kwa kuongeza 800 µl methanoli, kisha ikapozwa kwa -20 °C kwa saa 1, kisha ikawekwa kwenye centrifuge kwa 20,000 g kwa dakika 10 kwa 4 °C. Supernatant kisha ilichambuliwa na HPLC-MS/MS. Ili kuzima joto na kuzima protini zinazotumika katika kundi la udhibiti, protini ziliwekwa kwenye incubator katika 50% glycerol katika PBS kwa dakika 20 kwa 95 °C.
Kwa shughuli ya EPP ndani ya vitro, protini iliwekwa kwenye incubator na 3D20E22P (sawa na kiasi kilichopatikana katika jozi 18 za MAG, iliyosafishwa na HPLC-MS/MS) katika bafa ya 100 µl (pH 7.5) iliyo na Tris 25 mM, asidi asetiki 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, 0.1 mM EDTA, na 1 mM DTT kwa saa 3 kwa 27 °C. Mwitikio ulisimamishwa kwa kuongeza methanoli 400 µl na kupozwa kwa -20 °C kwa saa 1, kisha kuchujwa kwa centrifuge kwa 20,000 g kwa dakika 10 kwa 4 °C. Supernatant ilichambuliwa na HPLC-MS/MS.
Vipande vya PCR vya EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) na EcK2 (556 bp) viliongezwa kutoka kwa cDNA iliyoandaliwa kutoka kwa maiti ya mbu wasio na vichwa vya jinsia mchanganyiko. Kipande cha PCR cha udhibiti wa eGFP (495 bp) kiliongezwa kutoka kwa pCR2.1-eGFP iliyoelezwa hapo awali; Vitangulizi vya PCR vimeorodheshwa katika Jedwali la Data Iliyopanuliwa 2. Kipande cha PCR kiliingizwa kati ya vitangulizi vya T7 vilivyogeuzwa kwenye plasmidi ya pL4440. Miundo ya plasmidi ilipatikana kutoka kwa E. coli yenye uwezo wa NEB 5-α (New England Biolabs) na kuthibitishwa kwa mpangilio wa DNA kabla ya matumizi (tazama Data ya Nyongeza 1 kwa mfuatano wa kuingiza). Vitangulizi vilivyolinganishwa na kitangulizi cha T7 (Jedwali la Data Iliyopanuliwa 2) vilitumika kukuza kiingilio kutoka kwa plasmidi inayotegemea pL4440. Ukubwa wa bidhaa ya PCR ulithibitishwa na electrophoresis ya jeli ya agarose. dsRNA ilinakiliwa kutoka kwa violezo vya PCR kwa kutumia Kitengo cha Unukuzi cha Megascript T7 (Thermo Fisher) na kusafishwa kulingana na maagizo ya mtengenezaji pamoja na marekebisho yaliyoelezwa hapo awali.
Kwa sindano ya dsRNA, 1,380 ng ya dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ilidungwa kwa mkusanyiko wa 10 ng nl-1 kwenye kifua cha wanaume au wanawake wazima (Nanoject III, Drummond) ndani ya siku 1 baada ya kufungwa. Viwango vya kushuka kwa jeni viliamuliwa katika angalau nakala tatu za kibiolojia kwa kutumia uchimbaji wa RNA, usanisi wa cDNA, na RT-qPCR. Kwa sindano ya ecdysone, wanawake bikira wa siku 4 au bikira wa siku 6 waliolishwa damu walidungwa 0.13, 0.21, au 0.63 µg ya 20E au 3D20E (Nanoject III, Drummond) kwa viwango vya 1.3, 2.1, mtawalia, kulingana na muundo wa majaribio au 6.3 ng nl-1. Choma 100 nl ya 10% (vol/vol) ethanoli. ndani ya maji; 100 nl ya 3D20E22P katika 10% ya ethanoli (sawa na 75% ya kiasi kilichopatikana katika jozi ya MAG). Mbu waliwekwa kwa nasibu kwa kundi lililodungwa sindano.
Kwa ajili ya majaribio ya kutaga mayai, mbu wa kike wa siku 3 walilishwa bila malipo kwa damu ya binadamu. Ondoa mbu waliolishwa kidogo au ambao hawakulishwa. Kulingana na matibabu, mbu wa kike waliwekwa katika vikombe tofauti vya kutaga mayai kwa usiku nne angalau saa 48 baada ya mlo wa damu. Mayai yalihesabiwa chini ya stereoscope (Stemi 508, Zeiss); kwa mbu wa kike waliopandishwa, mayai yaliyoanguliwa na kuwa mabuu yalichukuliwa kuwa na rutuba.
Kwa majaribio ya kujamiiana, majike waliruhusiwa angalau siku 2 kulingana na matibabu ili kukuza upinzani dhidi ya kujamiiana, na madume wa aina ya porini waliolingana na umri baadaye waliingizwa kwenye ngome hiyo hiyo. Usiku mbili baadaye, vilengelenge vya kike vilivyorutubishwa vilikatwakatwa na DNA ya jenomu ilitolewa kwa kugandisha na kufyonza na kusambaza sauti kwenye bafa yenye 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, na 25 mM NaCl (pH 8.2). Sampuli ziliwekwa ndani ya Proteinase K (0.86 µg µl-1) kwa dakika 15 kwa 55 °C, ikifuatiwa na dakika 10 kwa 95 °C. Maandalizi ya DNA ya jenomu ghafi yalipunguzwa maji mara 10 na kufanyiwa uchunguzi wa qPCR wa mfuatano wa kromosomu ya Y; vitangulizi vimeorodheshwa katika Jedwali la Data Iliyoongezwa 2. Kutokuwepo kwa mfuatano wa kromosomu ya Y kunaonyesha kutokujamiana.
Kwa ajili ya majaribio ya kujamiiana upya, wanawake waliolazimishwa walichunguzwa kwa uwepo wa viziba vya kujamiiana ili kuthibitisha hali ya kujamiiana na kuruhusu siku 2 kukuza upinzani dhidi ya kujamiiana bila wanaume, kama ilivyoelezwa hapo awali. 36. Wanaume waliobeba mbegu za kiume zilizobadilishwa jeni za DsRed kisha waliingizwa kwenye vizimba vya wanawake. Usiku mbili baadaye, vilengelenge vya kurutubisha vilikatwa kutoka kwa wanawake, na DNA ya kijenetiki iliandaliwa kama ilivyoelezwa hapo juu na kufanyiwa uchunguzi wa qPCR wa transgene ya DsRed; vitangulizi vimeorodheshwa katika Jedwali la Data Iliyoongezwa 2. Kutokuwepo kwa transgene ya DsRed kulionyesha kuwa hakuna kujamiiana tena kulitokea.
3D20E ilitengenezwa kama ilivyoelezwa hapo awali 37. Kwa ufupi, 10 mg ya 20E (Sigma-Aldrich) iliyeyushwa katika 10 ml ya maji, ikifuatiwa na kuongezwa kwa 30 mg ya platinamu nyeusi (katika umbo la unga, Sigma-Aldrich). Mtiririko mpole wa O2 uliongezwa mfululizo kwenye mchanganyiko wa mmenyuko, ambao ulikorogwa kwenye halijoto ya kawaida. Baada ya saa 6, 30 mL ya methanoli iliongezwa ili kuzuia mmenyuko. Mchanganyiko ulisukumwa ili kuondoa chembe za kichocheo. Supernatant ilivukizwa hadi ikauke kwenye utupu kwenye halijoto ya kawaida. Bidhaa ya mmenyuko iliyokaushwa iliyeyushwa katika 10% ya ethanoli na methanoli kwa ajili ya sindano kwa ajili ya uchambuzi wa HPLC-MS/MS. Kiwango cha ubadilishaji (kutoka 20E hadi 3D20E) kilikuwa takriban 97% (Mchoro 4b), na wigo wa MS wa 3D20E iliyotengenezwa ulilingana na uliopatikana kwa wanawake waliofugwa (Mchoro 4c).
Hadithi hii ina maelezo mahususi ya majaribio ya takwimu yaliyofanywa. GraphPad (toleo la 9.0) ilitumika kufanya jaribio halisi la Fisher, jaribio la Mantel-Cox, na jaribio la t la Mwanafunzi. Majaribio ya Cochran-Mantel-Haenszel yalifanywa kwa kutumia hati maalum ya R (inapatikana katika https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Usambazaji wa data ulijaribiwa kwa uhalisia kwa kutumia jaribio la Shapiro-Wilk lenye kizingiti cha umuhimu cha 0.05. Wakati data iliposhindwa jaribio la uhalisia, jaribio la Mann-Whitney lilifanywa. Data ya kuishi ilichambuliwa kwa kutumia jaribio la Mantel-Cox. Kifurushi cha DESeq2 (toleo la 1.28.1) kilitumika kufanya uchambuzi wa usemi tofauti wa kiwango cha jeni cha RNA-seq. Upau mlalo kwenye grafu unawakilisha wastani. Thamani ya umuhimu ya P = 0.05 ilitumika kama kizingiti cha majaribio yote.
Kwa maelezo zaidi kuhusu muundo wa utafiti, tazama muhtasari wa Ripoti ya Utafiti wa Mazingira uliounganishwa na makala haya.
Data ya proteomiki ya MS iliwekwa kwenye Muungano wa ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) kupitia Hifadhi ya Washirika ya PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) kwa kutumia kitambulisho cha seti ya data PXD032157.
Seti ya data ya RNA-seq imewekwa katika Maktaba Kamili ya Usemi wa Gene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) chini ya rekodi ya mfululizo ya GSE198665.
Seti za data za ziada zinazozalishwa na/au kuchanganuliwa wakati wa utafiti wa sasa zinaweza kupatikana kutoka kwa waandishi husika kwa ombi linalofaa. Makala haya yanatoa data chanzo.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroid za ngono za wadudu zilizopuuzwa? Mwanaume: Black Box. Sayansi ya Wadudu.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone na ukuaji wa ovari katika Anopheles stephens.J. Fiziolojia ya Wadudu.28, 97–109 (1982).
Muda wa chapisho: Julai-08-2022