Upangaji wa protini katika njia ya usiri ni muhimu kwa kudumisha ugawaji wa seli na homeostasis. Mbali na upangaji unaosababishwa na ganda, jukumu la lipidi katika upangaji wa kinesini katika mchakato wa usafirishaji wa usiri ni swali la msingi la muda mrefu ambalo bado halijajibiwa. Hapa, tunafanya upigaji picha wa wakati halisi wa 3D kwa wakati mmoja wa rangi nyingi zenye azimio kubwa ili kuthibitisha katika mwili kwamba protini zilizotengenezwa hivi karibuni za glycosylphosphatidylinositol zenye lipidi ndefu sana za kauri zimeunganishwa na kuainishwa katika endoplasmi maalum. Tovuti ya kutoka, ambayo ni tofauti na ile inayotumiwa na protini za transmembrane. Kwa kuongezea, tunaonyesha kwamba urefu wa mnyororo wa kauri kwenye utando wa retikulamu ya endoplasmi ni muhimu kwa uteuzi huu wa upangaji. Utafiti wetu unatoa ushahidi wa kwanza wa moja kwa moja katika mwili wa kuainisha mizigo ya protini kulingana na urefu wa mnyororo wa lipidi katika maeneo teule ya usafirishaji katika njia ya usiri.
Katika seli za yukariyoti, protini zinazotengenezwa katika retikulamu ya endoplasmi (ER) hupangwa wakati wa usafirishaji kupitia njia ya usiri kwa ajili ya kupelekwa kwenye sehemu yao inayofaa ya seli (1). Mbali na upangaji unaosimamiwa na koti, ilidhaniwa kwa muda mrefu kwamba lipidi fulani zinaweza pia kutumika kama sehemu teule za kutoka kwa kuziunganisha katika maeneo maalum ya utando ambayo protini maalum (2-5). Hata hivyo, bado kuna ukosefu wa ushahidi wa moja kwa moja katika mwili ili kuthibitisha utaratibu huu unaowezekana wa msingi wa lipidi. Ili kutatua tatizo hili la msingi, tulisoma katika chachu jinsi protini zilizounganishwa na glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) zinavyosafirishwa tofauti kutoka ER. GPI-APs ni aina mbalimbali za protini za uso wa seli zilizounganishwa na lipidi (6, 7). GPI-AP ni protini iliyotengwa iliyounganishwa na vipeperushi vya nje vya utando wa plasma kupitia sehemu ya glycolipidi (nanga ya GPI). Zinakubali nanga za GPI kama marekebisho ya kihafidhina baada ya tafsiri katika lumen ya ER (8). Baada ya kuunganishwa, GPI-AP hupitia kifaa cha Golgi (5, 9) kutoka ER hadi kwenye utando wa plasma. Uwepo wa nanga za GPI husababisha GPI-AP kusafirishwa kando na protini zilizotolewa kwa utando wa transmembrane (ikiwa ni pamoja na protini zingine za utando wa plasma) kando ya njia ya usiri (5, 9, 10). Katika seli za chachu, GPI-AP hutenganishwa na protini zingine zilizotolewa kwenye retikulamu ya endoplasmic, na kisha hufungashwa kwenye vilengelenge vya kipekee vilivyofungwa na protini tata ya kanzu II (COPII) (6, 7). Vigezo vya mchakato huu wa uainishaji katika mchakato wa usafirishaji wa ER haviko wazi, lakini inakisiwa kwamba utaratibu huu unaweza kuhitaji lipidi, haswa urekebishaji wa kimuundo wa sehemu ya lipidi ya nanga ya GPI (5, 8). Katika chachu, urekebishaji wa lipidi za GPI huanza mara tu baada ya GPI kuunganishwa, na katika hali nyingi, husababisha kauri kufungamana na asidi ya mafuta iliyojaa ya mnyororo mrefu ya kaboni 26 (C26:0) (11, 12). Ceramide ya C26 ndiyo kauri kuu inayozalishwa na seli za chachu hadi sasa. Imetengenezwa katika ER na sehemu kubwa yake husafirishwa hadi kwenye kifaa cha Golgi kupitia vilengelenge vya COPII (13). Usafirishaji wa ER wa GPI-AP unahitaji hasa usanisi unaoendelea wa kauri (14, 15), na kwa upande mwingine, ubadilishaji wa kauri kuwa inositol phosphate ceramide (IPC) katika kifaa cha Golgi hutegemea usanisi wa nanga wa GPI (16). Uchunguzi wa kibiolojia na utando bandia umeonyesha kuwa kauri ndefu sana za mnyororo wa acyl zinaweza kuungana ili kuunda vikoa vilivyopangwa vyenye sifa za kipekee za kimwili (17, 18). Data hizi zinaongoza kwenye dhana kwamba kauri ya C26 na GPI-AP pamoja na kauri ya C26 hutumia sifa zao za kimwili kuungana katika maeneo au maeneo yenye mpangilio mzuri katika mazingira ya lipidi ya utando wa ER yenye fujo. Inaundwa zaidi na gliserilipidi fupi na zisizojaa (C16:1 na C18:1) (19, 20). Maeneo haya yatalenga kwa uangalifu maeneo maalum ya kutokea kwa ER (ERES), ambapo GPI-AP inayotokana na kauri na kauri inaweza kusafirishwa pamoja hadi Golgi katika kilele kimoja maalum cha COPII (5).
Katika utafiti huu, tumejaribu moja kwa moja utaratibu huu unaotegemea lipidi kwa kutumia hadubini ya upigaji picha ya wakati halisi ya hali ya juu (SCLIM), ambayo ni mbinu ya kisasa ya hadubini ambayo inaweza kuchunguza protini zenye lebo za fluorescent kwa wakati mmoja. Picha za rangi tatu na zenye pande tatu (3D) zina azimio na kasi ya juu sana katika seli hai (21, 22).
Kwanza tulitumia teknolojia ya SCLIM kufafanua zaidi jinsi GPI-AP ya kawaida yenye kundi la kauri la C26 ilivyochunguzwa kutoka kwa protini zilizotolewa na transmembrane baada ya kutoka ER katika S. cerevisiae. Ili kuangalia uainishaji wa ER, tulitumia mfumo wa kijenetiki ambao unaweza kuibua moja kwa moja mizigo mipya iliyotengenezwa inayoingia ERES mwilini (7, 23). Kama mizigo, tulichagua GPI-AP Gas1 inayotokana na kauri ya C26 iliyoandikwa na protini ya kijani ya fluorescent (GFP) na protini iliyotolewa na transmembrane Mid2 iliyoandikwa na protini ya fluorescent iliyo karibu na infrared (iRFP), zote mbili ambazo zinalenga utando wa plasma (24–26). Katika mutant inayoweza kuathiriwa na joto ya sec31-1, mizigo hii miwili huonyeshwa chini ya kichocheo kinachoweza kutolewa na galactose na alama ya ERES. Katika halijoto kali (37°C), kwa sababu mabadiliko ya sec31-1 huathiri utendaji kazi wa sehemu ya kauri ya COPII Sec31 ili kuzuia kuota kwa COPII na usafirishaji wa ER, mizigo mipya iliyotengenezwa hujilimbikiza kwenye ER (23). Baada ya kupoa hadi halijoto ya chini (24°C), seli zilizobadilika za sec31-1 zilipatikana kutoka eneo la usiri, na shehena mpya ya sintetiki iliyokusanywa ilianza kusafirishwa kutoka ER. Taswira ya CLIM ilionyesha kuwa nyingi ya protini mpya za Gas1-GFP na Mid2-iRFP zilizotengenezwa upya bado zilikusanyika katika ER ya seli zilizobadilika za sec31-1 baada ya kuanguliwa kwa 37°C na kisha kutolewa kwa 24°C kwa dakika 5 (Mchoro 1). Kwa kuwa Mid2-iRFP inasambazwa kwenye utando mzima wa ER, na Gas1-GFP imejilimbikizia na kukusanywa katika eneo la utando wa ER lisiloendelea, usambazaji wao ni tofauti kabisa (Mchoro 1, A hadi C na Movie S1). Kwa kuongezea, kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1D, kundi la Gas1-GFP halina Mid2-iRFP. Matokeo haya yanaonyesha kuwa protini za GPI-AP na transmembrane zilitenganishwa katika maeneo tofauti ya utando wa ER mapema. Kundi la Gas1-GFP liko karibu na ERES maalum iliyoandikwa kwa protini ya COPII ya mCherry Sec13 (Mchoro 1, E na F, na filamu S1) (23).
Seli za sec31-1 huonyesha ute unaosababishwa na galaktosi, mnyororo mrefu wa asili (C26) kauri GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, kijani) na protini ya transmembrane Mid2-iRFP (TMP, bluu) na lebo hii ya Constructive ERES yenye Sec13-mCherry (ERES, magenta) iliwekwa kwenye joto la 37°C kwa dakika 30, ikahamishwa hadi 24°C, na kupigwa picha na SCLIM dakika 5 baadaye. (A hadi C) inaonyesha picha ya mwakilishi iliyounganishwa au moja ya 2D ya ndege (A), picha ya makadirio ya 2D ya sehemu 10 za z (B) au picha ya hemisphere ya seli ya 3D ya mizigo na alama za ERES (C). Upau wa kipimo 1μm (A na B). Kitengo cha kipimo ni 0.551μm (C). Gas1-GFP iligunduliwa katika maeneo au makundi tofauti ya ER, huku Mid2-iRFP ikigunduliwa na kusambazwa katika utando wote wa ER (C). (D) Grafu inaonyesha kiwango cha mwangaza wa Gas1-GFP na Mid2-iRFP katika nguzo ya Gas1-GFP kando ya mstari mweupe wa mshale (kushoto). AU, kitengo cha kiholela. (E na F) zinawakilisha picha ya 3D inayochanganya bidhaa na alama ya ERES. Nguzo za Gas1-GFP ziligunduliwa karibu na ERES maalum. Kitengo cha kipimo ni 0.551μm. (F) Mshale mweupe imara unaashiria nguzo ya Gas1-GFP inayohusishwa na ERES. Paneli za kati na kulia zinaonyesha picha ya 3D iliyounganishwa iliyopanuliwa na mwonekano unaozunguka wa nguzo iliyochaguliwa ya Gas1-GFP.
Uhusiano wa karibu wa nafasi kati ya kundi la Gas1-GFP na ERES maalum unaonyesha kwamba Gas1-GFP inaweza kuingia kwenye ERES teule, ambayo ni tofauti na uteuzi unaotumiwa na Mid2-iRFP kuondoka kwenye ER. Ili kushughulikia uwezekano huu, tulipima uwiano wa ERES kwa bidhaa moja au mbili pekee (Mchoro 2, A hadi C). Tuligundua kuwa ERES nyingi (70%) zina aina moja tu ya mizigo. Picha ya chini ya Mchoro 2C inaonyesha mifano miwili ya kawaida ya ERES yenye Gas1-GFP pekee (Mchoro 1) au Mid2-iRFP pekee (Mchoro 2). Kwa upande mwingine, takriban 20% ya ERES ina mizigo miwili inayoingiliana katika eneo moja. Ilibainika kuwa baadhi ya ERES (10%) zilikuwa na aina mbili za mizigo, lakini zilitengwa katika maeneo tofauti kabisa. Kwa hivyo, uchambuzi huu wa takwimu unaonyesha kwamba baada ya ER kusafirishwa nje, GPI-AP Gas1-GFP na mizigo ya transmembrane Mid2-iRFP zimegawanywa katika ERES tofauti (Mchoro 2D). Ufanisi huu wa upangaji unaendana sana na uchambuzi wa awali wa kibiokemikali (6) na uamuzi wa kimofolojia (7). Tunaweza pia kuona tabia ya shehena iliyotengwa inayoingia ERES (Mchoro 2E na Movie S2). Mchoro 2E unaonyesha kuwa sehemu ndogo tu ya Gas1-GFP (paneli 3) au Mid2-iRFP (paneli 4) huingia ERES kutoka upande mmoja na imefungwa katika eneo tofauti. Jopo la 5 la Mchoro 2E linaonyesha kuwa Gas1-GFP na Mid2-iRFP wakati mwingine hupatikana katika ERES sawa, lakini huingia kutoka pande tofauti na zimejikita katika maeneo tofauti ambayo yanaweza kuwakilisha vilengelenge tofauti vya COPII. Pia tulithibitisha kwamba utenganisho na uainishaji ulioonekana wa GPI-AP Gas1 inayotokana na C26 kauri kama ERES teule ni maalum kwa sababu shehena nyingine ya usiri wa transmembrane, protini ya utando wa plasma iliyo na lebo ya GFP Axl2 (27), inayoonyesha tabia sawa na Mid2-iRFP. (Picha S1 na Movie S3). Axl2-GFP iliyotengenezwa hivi karibuni inasambazwa kupitia utando wa ER kama Mid2-iRFP (Mchoro S1, A na B), na imewekwa pamoja na Mid2-iRFP katika ERES nyingi (Mchoro S1, B hadi D). Paneli 1 na 2 za Mchoro 1. S1C inaonyesha mifano miwili ya kawaida ya ERES ambapo mizigo miwili ya transmembrane inaingiliana. Katika visa hivi, bidhaa zote mbili huingia ERES pamoja (Mchoro S1E, Paneli 3 na Movie S3).
Seli za sec31-1 zinazoonyesha ute wa galaktosi unaoweza kutolewa, Gas1-GFP (GPI-AP, kijani) na Mid2-iRFP (TMP, bluu) na lebo za ERES zenye muundo wa Sec13-mCherry (ERES, magenta) ziliwekwa kwenye 37. Baada ya kuanguliwa kwa dakika 30 kwa °C, songa hadi 24 °C ili kutoa kizuizi cha ute, na picha na SCLIM baada ya dakika 20. (A hadi C) Picha wakilishi za makadirio ya 2D (A; upau wa kipimo, 1μm) au picha za hemisphere ya seli ya 3D (B na C; kitengo cha kipimo, 0.456μm) ya mzigo na sehemu 10 za z zilizowekwa alama na ERES. Paneli ya chini katika (B) na paneli katika (C) zinaonyesha picha zilizosindikwa ili kuonyesha bidhaa zilizopo katika ERES (magenta) pekee [Gas1-GFP (kijivu) na Mid2-iRFP (bluu nyepesi)]. (C) Mshale wazi: ERES hubeba kipande kimoja tu cha mzigo (1 hadi 4). Mshale wa kijivu: ERES ina mzigo uliotengwa (5). Mshale mweupe imara: ERES ina mzigo uliowekwa pamoja. Chini: ERES moja iliyochaguliwa ina Gas1-GFP (1) au Mid2-iRFP (2) pekee. Upau wa kipimo, 100 nm. (D) Upimaji wa mikrografu ya picha iliyoelezwa katika (C). Asilimia ya wastani ya ERES ambayo ina mzigo mmoja tu (Gas1-GFP au Mid2-iRFP), mzigo uliotengwa na mzigo unaoingiliana. Katika majaribio matatu huru, n=432 katika seli 54. Upau wa hitilafu = SD. Jaribio la t lisilo na mikia miwili. *** P = 0.0002. (E) Picha ya 3D ya ERES iliyochaguliwa ya mzigo uliowekwa karantini uliowekwa alama na (C). Gas1-GFP (kijani) (3) au Mid2-iRFP (bluu) (4) huingia ERES (magenta) kutoka upande mmoja na imezuiliwa kwa eneo dogo ndani ya ERES. Wakati mwingine, aina zote mbili za mizigo huingia kwenye ERES (5) sawa kutoka upande mmoja na huwekwa kwenye eneo lililotengwa ndani ya ERES. Upau wa kipimo, 100 nm.
Kisha, tulijaribu dhana kwamba kauri ndefu ya mnyororo wa acyl (C26) iliyopo kwenye utando wa ER huendesha mkusanyiko na upangaji maalum wa Gas1 katika ERES teule. Kwa lengo hili, tulitumia aina ya chachu iliyorekebishwa ya GhLag1, ambapo synthases mbili za kauri za asili za Lag1 na Lac1 zilibadilishwa na GhLag1 (homolog ya Lag1 ya pamba), na kusababisha aina ya chachu yenye utando wa seli aina ya Ceramide fupi kuliko aina ya pori (Mchoro 3A) (28). Uchambuzi wa Mass spectrometry (MS) ulionyesha kuwa katika aina za pori, 95% ya jumla ya kauri ni ndefu sana (C26) mnyororo wa kauri, huku katika GhLag1, 85% ya kauri ni ndefu sana (C18 na C16). ), 2% tu ya kauri ni ndefu sana (C26) mnyororo wa kauri. Ingawa kauri za C18 na C16 ndizo kauri kuu zilizogunduliwa kwenye utando wa GhLag1 hadi sasa, uchambuzi wa MS pia ulithibitisha kwamba nanga ya GPI ya Gas1-GFP iliyoonyeshwa katika aina ya GhLag1 ina kauri za C26, ambazo zinalingana na lipidi za aina ya mwitu. Ubora ni sawa (Mchoro 3A) (26). Kwa hivyo, hii ina maana kwamba kimeng'enya cha kurekebisha kauri cha Cwh43 kinachagua sana kauri za C26, kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 26, kinajumuisha vyema nanga ya GPI kutoka kwa kiasi kidogo cha kauri za C26 katika aina ya GhLag1. S2 (29). Hata hivyo, utando wa seli wa GhLag1 kimsingi una kauri za C18-C16 pekee, huku Gas1-GFP bado ina kauri za C26. Ukweli huu hufanya aina hii kuwa kifaa bora cha kutatua tatizo la urefu wa mnyororo wa acyl wa kauri za utando katika ER. Jukumu la kinadharia la darasa na upangaji. Kisha, kwanza tulisoma uwezo wa C26 Gas1-GFP kujikusanya katika makundi katika GhLag1 na aleli ya mutant nyeti kwa halijoto ya sec31-1 kupitia hadubini ya kawaida ya fluorescence, ambapo ni mnyororo mrefu (C18-C16) pekee uliopo kwenye utando wa ER Ceramide (Mchoro 3). Tuliona kwamba katika sec31-1, Gas1-GFP nyingi zilijilimbikizia katika makundi, huku Gas1-GFP katika sec31-1 GhLag1 yenye utando mrefu (C18-C16) wa kauri ER haukuunganishwa na kusambazwa katika utando mzima wa ER. Kwa usahihi, kwa sababu makundi yanayotegemea kauri C26 yanahusiana kwa karibu na ERES maalum (Mchoro 1), baadaye tulichunguza kama mchakato huu unaweza pia kuhusisha kazi ya utaratibu wa protini ya usafirishaji wa ER. GPI-AP inatumia mfumo maalum wa COPII kwa usafirishaji wa ER, ambao unadhibitiwa kikamilifu na urekebishaji wa kimuundo wa Ted1 wa sehemu ya glycan ya nanga ya GPI (30, 31). GPI-glycan iliyounganishwa tena hutambuliwa na mchanganyiko wa kipokezi cha mizigo cha transmembrane p24, ambacho huajiri Lst1 kwa hiari, ambayo ni isoform maalum ya kitengo kikuu cha kuunganisha mizigo cha COPII Sec24, na kutengeneza Vipele vya COPII vyenye GPI-AP ni muhimu (31-33). Kwa hivyo, tuliunda mutant maradufu iliyochanganya uondoaji wa protini hizi moja (kipengele tata cha p24 Emp24, kimeng'enya kinachorekebisha GPI-glycan Ted1 na kitengo maalum cha COPII Lst1) na aina ya mutant ya sec31-1, na tukavisoma. Je, inawezekana kuunda kundi la Gas1-cluster GFP (Mchoro 3). Tuliona kwamba katika sec31-1emp24Δ na sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP haijaunganishwa na kusambazwa katika utando wote wa ER, kama ilivyoonekana hapo awali katika sec31-1 GhLag1, huku katika sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Kama sec31-1. Matokeo haya yanaonyesha kwamba pamoja na uwepo wa kauri ya C26 kwenye utando wa ER, mkusanyiko wa Gas1-GFP pia unahitaji kuunganishwa na tata ya p24, na hauhitaji uajiri maalum wa Lst1. Kisha, tulichunguza uwezekano kwamba urefu wa mnyororo wa kauri kwenye utando wa ER unaweza kudhibiti ufungaji wa Gas1-GFP hadi p24. Hata hivyo, tuligundua kuwa uwepo wa kauri ya C18-C16 kwenye utando hauathiri GPI-glycans zilizojengwa upya na tata ya p24 (Michoro S3 na S4, A na B) au kufungamana na uwezo wa GPI-AP na kusafirisha GPI-AP. Kuajiri aina ndogo ya COPII Lst1 (Mchoro S4C). Kwa hivyo, mkusanyiko unaotegemea kauri ya C26 hauhitaji mwingiliano wa protini na mifumo tofauti ya protini ya usafirishaji wa ER, lakini inasaidia utaratibu mbadala wa upangaji unaoendeshwa na urefu wa lipidi. Kisha, tulichambua ikiwa urefu wa mnyororo wa kauri ya asili kwenye utando wa ER ni muhimu kwa uainishaji mzuri wa Gas1-GFP kama ERES teule. Kwa kuwa Gas1 katika aina ya GhLag1 yenye kauri fupi hutoka kwenye ER na kuingia kwenye utando wa plasma (Mchoro S5), tunaamini kwamba ikiwa upangaji unaendeshwa na urefu wa mnyororo wa kauri acyl, Gas1 katika aina ya GhLag1 inaweza kuelekezwa na kuvutwa. Bidhaa za ERES zenye utando sawa.
(A) Utando wa seli wa GhLag1 una hasa kauri fupi za C18-C16, huku nanga ya GPI ya Gas1-GFP bado ina C26 IPC sawa na seli za aina ya porini. Hapo juu: uchambuzi wa urefu wa mnyororo wa acyl wa kauri kwenye utando wa seli wa aina ya porini (Wt) na aina ya GhLag1p kwa kutumia spektrometri ya wingi (MS). Data inawakilisha asilimia ya jumla ya kaurini. Wastani wa majaribio matatu huru. Upau wa hitilafu = SD. Jaribio la t lenye mikia miwili lisilooanishwa. **** P ＜0.0001. Paneli ya chini: Uchambuzi wa MS wa urefu wa mnyororo wa acyl wa IPC uliopo katika nanga ya GPI ya Gas1-GFP (GPI-IPC) iliyoonyeshwa katika aina ya porini na aina ya GhLag1p. Data inawakilisha asilimia ya jumla ya ishara ya IPC. Wastani wa majaribio matano huru. Upau wa hitilafu = SD. Jaribio la t lenye mikia miwili lisilooanishwa. ns, si muhimu. P = 0.9134. (B) Mikrografu za mwangaza wa sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ na sec31-1lst1Δ zinazoonyesha Gas1-GFP inayosababishwa na galaktosi ziliwekwa kwenye joto la 37°C kwa dakika 30 na kupitishwa chini kwa ajili ya kufanya hadubini ya mwangaza wa kawaida baada ya 24°C. Mshale mweupe: ER Gas1-GFP kundi. Mshale ulio wazi: Gas1-GFP isiyo na mkusanyiko imesambazwa kwenye utando mzima wa ER, ikionyesha rangi ya pete ya nyuklia ya ER. Upau wa kipimo, 5μm. (C) Upimaji wa mikrografu ya picha iliyoelezwa katika (B). Asilimia ya wastani ya seli zilizo na muundo wa Gas1-GFP. Katika majaribio matatu huru, seli n≥300. Upau wa hitilafu = SD. Jaribio la t lisilo na mikia miwili. **** P ＜0.0001.
Ili kutatua tatizo hili moja kwa moja, tulifanya taswira ya SCLIM ya Gas1-GFP na Mid2-iRFP katika GhLag1 na aleli ya mutant inayohisi joto ya sec31-1 (Mchoro 4 na Movie S4). Baada ya ER kubaki kwenye 37°C na baadaye kutolewa kwenye 24°C, Gas1-GFP nyingi mpya iliyotengenezwa haikuunganishwa na kusambazwa kwenye utando wote wa ER, kama inavyoonekana na darubini za kawaida (Mchoro 4, A na B). Kwa kuongezea, asilimia kubwa ya ERES (67%) inajumuisha aina mbili za mizigo iliyoko ndani yake (Mchoro 4D). Paneli 1 na 2 za Mchoro 4C zinaonyesha mifano miwili ya kawaida ya ERES yenye Gas1-GFP inayoingiliana na Mid2-GFP. Kwa kuongezea, bidhaa zote mbili zilikusanywa katika ERES sawa (Mchoro 4E, paneli 3 na movie S4). Kwa hivyo, matokeo yetu yanaonyesha kuwa urefu wa mnyororo wa asili ya kauri kwenye utando wa ER ni kigezo muhimu cha mkusanyiko na uainishaji wa protini ya ER.
Seli za Sec31-1 GhLag1 zinazoonyesha ute unaosababishwa na galaktosi, Gas1-GFP (GPI-AP, kijani) na Mid2-iRFP (TMP, bluu) na Sec13-mCherry (ERES, magenta) zenye lebo ya ERES (ERES, magenta) huangukia kwenye 37°C. Endelea kwa dakika 30, shuka hadi 24°C ili kutoa ute, na picha ikiwa na SCLIM baada ya dakika 20. (A hadi C) Picha wakilishi za makadirio ya 2D (A; upau wa kipimo, 1μm) au picha za hemisphere ya seli ya 3D (B na C; kitengo cha kipimo, 0.45μm) ya sehemu 10 za z zilizowekwa alama na mizigo na ERES. Paneli ya chini katika (B) na paneli katika (C) huonyesha picha zilizosindikwa ili kuonyesha bidhaa zilizopo katika ERES (magenta) [Gas1-GFP (kijivu) na Mid2-iRFP (bluu nyepesi)]. (C) Mshale mweupe uliojazwa: ERES, bidhaa huingiliana. Mshale wazi: ERES ina kipengee kimoja pekee. Paneli ya chini: ERES iliyochaguliwa ina bidhaa zinazoingiliana (1 na 2) zilizowekwa alama katika (C). Upau wa kipimo, 100 nm. (D) Upimaji wa mikrografu ya foto iliyoelezwa katika (C). Katika vitengo vya GhLag1 vya sec31-1 na sec31-1, ni mzigo mmoja tu (Gas1-GFP au Mid2-iRFP) uliojumuishwa, na asilimia ya wastani ya ERES kwa mizigo iliyotengwa na mizigo inayoingiliana. Katika majaribio matatu huru, n = 432 katika seli 54 (sec31-1) na n = 430 katika seli 47 (sec31-1 GhLag1). Upau wa hitilafu = SD. Jaribio la t lisilo na mikia miwili. *** P = 0.0002 (sec31-1) na ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Picha ya 3D ya ERES iliyochaguliwa yenye mzigo unaoingiliana (3) iliyowekwa alama katika (C). Gas1-GFP (kijani) na Mid2-iRFP (bluu) hukaribia ERES (magenta) kutoka upande mmoja na hubaki katika eneo lile lile lililowekewa vikwazo vya ERES. Upau wa kipimo, 100 nm.
Utafiti huu unatoa ushahidi wa moja kwa moja katika mwili kwamba mizigo ya protini inayotokana na lipidi imeainishwa katika maeneo teule ya usafirishaji katika njia ya usiri, na inaonyesha umuhimu wa urefu wa mnyororo wa acyl kwa uteuzi wa uainishaji. Kwa kutumia mbinu yenye nguvu na ya kisasa ya hadubini inayoitwa SCLIM, tulionyesha Gas1-GFP iliyotengenezwa hivi karibuni (utando mkuu wa plasma GPI-AP wenye sehemu ndefu sana ya lipidi ya acyl (C26) kauri) katika chachu. Maeneo yaliyounganishwa katika ER tofauti yanahusishwa na ERES maalum, huku protini zinazotolewa na transmembrane zikisambazwa katika utando wote wa ER (Mchoro 1). Kwa kuongezea, aina hizi mbili za bidhaa huingia ERES tofauti kwa kuchagua (Mchoro 2). Urefu wa mnyororo wa acyl wa kauri ya seli kwenye utando hupunguzwa kutoka C26 hadi C18-C16, kundi la Gas1-GFP huvurugika hadi eneo teule la ER, na Gas1-GFP huelekezwa upya ili kuacha ER na protini ya transmembrane kupitia ERES hiyo hiyo (Mchoro 3 na Mchoro 3). 4).
Ingawa GPI-AP hutumia utaratibu maalum wa protini kutoka ER, tuligundua kuwa utengano unaotegemea kauri ya C26 hautegemei mwingiliano tofauti wa protini ambao unaweza kusababisha utaalamu wa ERES (Michoro S4 na S5). Badala yake, matokeo yetu yanaunga mkono utaratibu mbadala wa uainishaji unaoendeshwa na mkusanyiko wa protini unaotegemea lipidi na kutengwa kwa mizigo mingine baadaye. Uchunguzi wetu unaonyesha kuwa eneo au kundi la Gas1-GFP linalohusishwa na ERES maalum halina protini inayotolewa na utando wa kati Mid2-iRFP, ambayo inaonyesha kwamba kundi la GPI-AP linalotegemea kauri ya C26 litawezesha kuingia kwao kwenye ERES husika, na wakati huo huo, kutengwa na utando wa kati. Uteuzi huingia kwenye ERES hii maalum (Michoro 1 na 2). Kwa upande mwingine, uwepo wa kauri ya C18-C16 kwenye utando wa kati wa ER hausababishi GPI-AP kuunda maeneo au makundi, kwa hivyo hazitenganishi au kubadilisha protini zinazotolewa na utando wa kati katika ERES hiyo hiyo (Michoro 3 na 4). Kwa hivyo, tunapendekeza kwamba kauri ya C26 iendeshe utenganisho na uainishaji kwa kuwezesha mkusanyiko wa protini zilizounganishwa na ERES maalum.
Jinsi ya kufikia mkusanyiko huu unaotegemea kauri ya C26 katika eneo maalum la ER? Tabia ya kauri ya utando kutengana kwa upande inaweza kusababisha kauri ya GPI-AP na C26 kuunda lipidi ndogo na zilizopangwa mara moja katika mazingira ya lipidi yasiyo ya kawaida ya utando wa ER ulio na glycerolipidi fupi na zisizojaa. Vikundi vya ubora (17, 18). Vikundi hivi vidogo vya muda vinaweza kuunganishwa zaidi katika vikundi vikubwa na imara zaidi baada ya kuunganishwa na mchanganyiko wa p24 (34). Sambamba na hili, tulionyesha kuwa C26 Gas1-GFP inahitaji kuingiliana na mchanganyiko wa p24 ili kuunda vikundi vikubwa vinavyoonekana (Mchoro 3). Mchanganyiko wa p24 ni oligoma yenye heterozygous iliyojumuishwa na protini nne tofauti za p24 transmembrane katika chachu (35), ambayo hutoa uunganishaji wa multivalent, ambao unaweza kusababisha uunganishaji wa vikundi vidogo vya GPI-AP, na hivyo kutoa kundi kubwa zaidi la Stable (34). Mwingiliano kati ya ectodomains za protini za GPI-APs unaweza pia kuchangia mkusanyiko wao, kama inavyoonyeshwa wakati wa usafirishaji wao wa Golgi katika seli za epithelial zenye polarized za mamalia (36). Hata hivyo, wakati C18-C16 kauri ipo kwenye utando wa ER, wakati p24 tata inapofungamana na Gas1-GFP, makundi makubwa tofauti hayataundwa. Utaratibu wa msingi unaweza kutegemea sifa maalum za kimwili na kemikali za kauri ndefu ya mnyororo wa acyl. Uchunguzi wa kibiolojia wa utando bandia unaonyesha kwamba ingawa kauri ndefu (C24) na fupi (C18-C16) mnyororo wa acyl zinaweza kusababisha utengano wa awamu, ni kauri ndefu za mnyororo wa acyl (C24) pekee ndizo zinaweza kukuza Curvature ya juu na kupinda kwa filamu ili kuunda upya filamu. Kupitia marejeleo ya pande zote mbili (17, 37, 38). Imeonyeshwa kuwa heliksi ya transmembrane ya TMED2, inayofanana na Emp24 kwa binadamu, huingiliana kwa hiari na sphingomyelini inayotokana na kauri ya C18 katika lobule za saitoplazimu (39). Kwa kutumia simulizi za mienendo ya molekuli (MD), tuligundua kuwa kauri zote mbili za C18 na C26 hujikusanya kuzunguka lobule za saitoplazimu za heliksi ya transmembrane ya Emp24, na zina mapendeleo sawa (Mchoro S6). Inafaa kuzingatia kwamba hii inaonyesha kwamba heliksi ya transmembrane ya Emp24 inaweza kusababisha usambazaji usio sawa wa lipidi kwenye utando. Hii ni matokeo ya hivi karibuni kulingana na seli za mamalia. Simulizi zinazofanana za MD pia zinaonyesha uwepo wa lipidi za etha (40). Kwa hivyo, tunadhania kwamba kauri ya C26 katika lobule mbili za ER26 imejazwa ndani. Wakati GPI-AP katika lobule za luminal inapojifunga moja kwa moja kwenye p24 yenye valenti nyingi na mkusanyiko wa kauri ya C26 karibu na p24 katika lobule za saitoplazimu, inaweza kukuza mkusanyiko wa protini unaoambatana na mkunjo wa utando huzalishwa kupitia vidole (41), na kusababisha GPI-AP kujitenga katika maeneo tofauti karibu na ERES, ambayo pia hupendelea maeneo yenye mikunjo mingi ya utando wa ER (42). Ripoti za awali ziliunga mkono utaratibu uliopendekezwa (43, 44). Kufunga kwa oligolectini, vimelea au kingamwili kwa glycosphingolipidi zinazotokana na kauri (GSL) kwenye utando wa plasma husababisha mkusanyiko mkubwa wa GSL, huongeza utengano wa awamu na husababisha mabadiliko ya utando na ujanibishaji wa ndani (44). Iwabuchi n.k. (43) Ilibainika kuwa mbele ya minyororo mirefu ya asili (C24) lakini si mifupi (C16), ligandi yenye vali nyingi iliyounganishwa na laktosylceramide ya GSL ilisababisha uundaji wa makundi makubwa na uvamizi wa utando, na uhamishaji wa ishara unaosababishwa na saitoplazimu ya Lyn kwenye vipeperushi hutenganishwa na minyororo ya asili katika neutrofili zilizounganishwa.
Katika seli za epithelial zenye polari za mamalia, mkusanyiko wa mtandao wa anti-Golgi (TGN) hadi kiwango cha utando wa plasma ya apical hudhibiti utenganisho na upangaji wa GPI-AP (10, 45). Mkusanyiko huu unaendeshwa na oligomerization ya GPI-AP (36), lakini inaweza pia kutegemea urefu wa mnyororo wa kauri tunaoupata katika chachu. Ingawa GPI-AP ya mamalia ina nanga inayotokana na lipidi ya etha, na muundo wake wa kemikali ni tofauti sana na kauri ndefu sana ya mnyororo wa acyl, utafiti wa hivi karibuni uligundua kuwa lipidi zote mbili zina sifa na utendaji kazi sawa wa kimwili na kemikali (40). Kwa hivyo, sehemu ya lipidi ya etha katika seli za mamalia inaweza kuwa sawa na kauri ya C26 katika chachu, na jukumu lake ni kuhusishwa na kauri ya mnyororo mrefu kwenye utando ili kukuza mkusanyiko na upangaji wa GPI-AP. Ingawa uwezekano huu bado unahitaji kupimwa moja kwa moja, matokeo ya awali yanaunga mkono kwamba usafirishaji wa kauri ndefu ya mnyororo wa asili hadi kwenye mwili wa Golgi haufanywi na protini za uhamishaji wa saitoplazimu, lakini inategemea usanisi wa nanga za GPI kama chachu. Kwa hivyo, utaratibu wa kihafidhina wa mageuko unaonekana kuwa na uwezo wa kusafirisha kwa hiari kauri ndefu sana ya mnyororo wa asili na GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) katika kilele kimoja cha usafirishaji.
Katika mifumo ya seli za epithelial zenye polari za chachu na mamalia, mkusanyiko wa GPI-AP na utengano kutoka kwa protini zingine za utando wa plasma zote hutokea kabla ya kufikia uso wa seli. Paladino et al. (48) waligundua kuwa kwenye TGN ya seli za epithelial zenye polari za mamalia, mkusanyiko wa GPI-AP sio muhimu tu kwa uainishaji teule wa GPI-APs kwenye utando wa plasma wa apical, lakini pia hudhibiti mpangilio wa makundi wa GPI-APs na shughuli zake za kibiolojia. Uso wa seli. Katika chachu, utafiti huu ulionyesha kuwa kundi la GPI-AP linalotegemea C26 kauri kwenye ER linaweza kudhibiti mpangilio wa kundi na shughuli za utendaji wa GPI-AP kwenye utando wa plasma (24, 49). Sambamba na mfumo huu, seli za GhLag1 zina mzio wa vizuizi vya GPI au dawa zinazoathiri uadilifu wa ukuta wa seli (28), na hitaji la makundi ya Gas1-GFP yanayofanya kazi (49) ya kauri ya ncha inayotarajiwa katika kuoanisha seli za chachu linaonyesha G​​​ Matokeo yanayowezekana ya kisaikolojia ya seli za hLag1. Hitilafu ya GPI-AP. Hata hivyo, kupima zaidi kama mpangilio wa utendaji kazi wa uso wa seli umepangwa kutoka kwa ER kwa njia ya upangaji kulingana na urefu wa lipidi itakuwa mada ya utafiti wetu wa baadaye.
Aina za Saccharomyces cerevisiae zilizotumika katika kazi hii zimeorodheshwa katika Jedwali S1. Aina za MMY1583 na MMY1635 za SCLIM kwa ajili ya upigaji picha wa seli hai zilijengwa nyuma ya W303. Aina hizi zinazoonyesha Sec13-mCherry zenye lebo ya protini ya fluorescent zilijengwa kwa kutumia mbinu inayotegemea mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi (PCR) kwa kutumia plasmidi ya pFA6a kama kiolezo (23). Aina inayoonyesha Mid2-iRFP iliyoandikwa na protini ya fluorescent chini ya udhibiti wa kipandishaji cha GAL1 ilijengwa kama ifuatavyo. Upanuzi wa PCR wa mfuatano wa iRFP-KanMx kutoka kwa vekta ya pKTiRFP-KAN (zawadi ya E. O'Shea, nambari ya plasmidi ya Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; kitambulisho cha rasilimali ya utafiti (RRID): Addgene_64687) Na kuingizwa kwenye sehemu ya mwisho ya C ya Mid2 ya asili. Baada ya mfuatano wa jenomu wa Mid2-iRFP kukuzwa na kuunganishwa kwenye kipandishi cha GAL1, kiliunganishwa kwenye tovuti ya Not I-Sac I ya pRS306 ya plasmidi ya ujumuishaji. PRGS7 ya plasmidi iliyotokana ilipangwa kwa mstari na Pst I ili kuunganishwa kwenye eneo la URA3.
Jeni la muunganisho wa Gas1-GFP linaonyeshwa chini ya udhibiti wa kipandishi cha GAL1 katika plasmidi ya sentromere (CEN), ambayo imejengwa kama ifuatavyo. Mfuatano wa Gas1-GFP uliongezwa kwa PCR kutoka kwa plasmidi ya pRS416-GAS1-GFP (24) (zawadi ya L. Popolo) na kuunganishwa kwenye tovuti ya Xma I–Xho I ya plasmidi ya CEN pBEVY-GL LEU2 (zawadi ya C). Miller; Nambari ya plasmidi ya Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasidi inayotokana iliitwa pRGS6. Jeni la muunganisho wa Axl2-GFP pia linaonyeshwa chini ya udhibiti wa kipandishi cha GAL1 cha vekta ya pBEVY-GL LEU2, na muundo wake ni kama ifuatavyo. Mfuatano wa Axl2-GFP uliongezwa kutoka kwa plasmidi ya pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) kwa PCR, na kuunganishwa kwenye tovuti ya Bam HI-Pst I ya vekta ya pBEVY-GL LEU2. Plasidi iliyotokana iliitwa pRGS12. Mfuatano wa oligonukleotidi zilizotumika katika utafiti huu umeorodheshwa katika Jedwali S2.
Aina hii iliongezewa adenini 0.2% na glukosi 2% [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] protini ya dondoo la chachu iliyojaa p (YP) (1% dondoo la chachu na 2% protini ept). (YPR)] au 2% galactose [YP-galactose (YPG)] kama chanzo cha kaboni, au katika kiwango cha chini cha sintetiki (0.15% msingi wa nitrojeni ya chachu na 0.5% sulfate ya amonia) ili kuongeza amino asidi na besi zinazohitajika kwa lishe, Na zenye 2% glukosi (kiwango cha chini cha glukosi ya sintetiki) au 2% galactose (kiwango cha chini cha galactose ya sintetiki) kama chanzo cha kaboni.
Kwa upigaji picha wa wakati halisi, seli zilizobadilika za sec31-1 zinazohisi halijoto zinazoonyesha muundo chini ya kipandishi cha GAL1 zilikuzwa katika hali ya wastani ya YPR kwa 24°C usiku kucha hadi awamu ya katikati ya logi. Baada ya kuingizwa katika YPG kwa 24°C kwa saa 1, seli ziliwekwa katika SG kwa 37°C kwa dakika 30, na kisha kuhamishiwa hadi 24°C ili kutolewa kutoka kwa kizuizi cha usiri. Concanavalin A ilitumika kurekebisha seli kwenye slaidi ya glasi na kupigwa picha na SCLIM. SCLIM ni mchanganyiko wa darubini ya fluorescence iliyogeuzwa ya Olympus IX-71 na lenzi ya mafuta ya kidirisha cha nambari cha UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), kichanganuzi cha diski ya confocal kinachozunguka kwa kasi ya juu na uwiano wa ishara-hadi-kelele (Yokogawa Electric), spektromita maalum, na upoezaji maalum. Kiongeza picha cha mfumo (Hamamatsu Photonics) kinaweza kutoa mfumo wa lenzi ya kukuza na ukuzaji wa mwisho wa ×266.7 na kamera ya kifaa kilichounganishwa na chaji ambayo huzidisha elektroni (Hamamatsu Photonics) (21). Upataji wa picha hufanywa na programu maalum (Yokogawa Electric). Kwa picha za 3D, tulitumia kiendeshaji cha piezoelectric kilichotengenezwa maalum ili kutikisa lenzi ya lengo wima, na kukusanya sehemu za macho zilizo umbali wa nm 100 katika mrundiko. Picha ya Z-stack hubadilishwa kuwa data ya voxel ya 3D, na kazi ya kinadharia ya kuenea kwa nukta inayotumika kwa darubini ya confocal ya diski inayozunguka hutumika kwa ajili ya usindikaji wa kuondoa mrundikano na programu ya Volocity (PerkinElmer). Kwa kutumia programu ya Volocity ili kupima kiotomatiki kiwango cha uchambuzi wa eneo pamoja, ERES ikiwa ni pamoja na mizigo ilipimwa. Uchambuzi wa skanisho la mstari ulifanywa kwa kutumia programu ya MetaMorph (Vifaa vya Masi).
Tumia programu ya GraphPad Prism ili kubaini umuhimu wa kitakwimu. Kwa jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili na jaribio la kawaida la uchanganuzi wa tofauti wa njia moja (ANOVA), tofauti kati ya vikundi zinachukuliwa kuwa na athari kubwa kwa P <0.05 (*).
Kwa hadubini ya fluorescence ya Gas1-GFP, seli za awamu ya logi zilikuzwa usiku kucha katika YPD na kukusanywa kwa kutumia centrifugation, zikaoshwa mara mbili na saline iliyo na fosfeti, na kuwekwa kwenye barafu kwa angalau dakika 15, kisha zikaendelea chini ya hadubini kama ilivyoelezwa hapo awali. Angalia (24). Hadubini ya Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) iliyo na lenzi ya lengo, kichujio cha L5 (GFP), kamera ya Hamamatsu na programu ya Application Suite X (LAS X) ilitumika kwa ajili ya ununuzi.
Sampuli ziliondolewa umbo kwa kutumia bafa ya sampuli ya SDS kwa joto la 65°C kwa dakika 10, na kisha kutengwa na electrophoresis ya jeli ya SDS-polyacrylamide (PAGE). Kwa uchambuzi wa kingamwili, 10 μl ya sampuli ilipakiwa kwa kila njia. Kingamwili ya msingi: Tumia anti-Gas1 ya sungura ya polyclonal katika mchanganyiko wa 1:3000, anti-Emp24 ya sungura ya polyclonal katika mchanganyiko wa 1:500, na anti-GFP ya sungura ya polyclonal (zawadi kutoka kwa H. Riezman) katika mchanganyiko wa 1:3000. Kingamwili ya monoclonal ya panya ya anti-Pgk1 ilitumika katika mchanganyiko wa 1:5000 (zawadi kutoka kwa J. de la Cruz). Kingamwili ya pili: Horseradish peroxidase (HRP) iliyounganishwa na mbuzi ya anti-sungura immunoglobulin G (IgG) iliyotumika katika mchanganyiko wa 1:3000 (Pierce). IgG ya mbuzi iliyounganishwa na HRP ilitumika kwa mchanganyiko wa 1:3000 (Pierce). Eneo la mwitikio wa kinga lilizingatiwa kwa kutumia mbinu ya chemiluminescence ya kitendanishi cha SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Kama ilivyoelezwa katika (31), jaribio la asili la kinga mwilini lilifanywa kwenye sehemu ya ER iliyoimarishwa. Kwa kifupi, osha seli za chachu kwa kutumia bafa ya TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride na mchanganyiko wa kizuizi cha protease) kwa 600 nm (OD600) kwa msongamano wa macho 100 mara mbili. Ilivunjwa kwa shanga za kioo, na kisha uchafu wa seli na shanga za kioo ziliondolewa kwa centrifugation. Supernatant kisha iliwekwa kwa centrifugation kwa 17,000 g kwa dakika 15 kwa 4°C. Kidonge kilisimamishwa tena katika TNE na digitalis saponin iliongezwa kwenye mkusanyiko wa mwisho wa 1%. Kusimamishwa kuliwekwa kwa saa 1 kwa mzunguko kwa 4°C, na kisha vipengele visivyoyeyuka viliondolewa kwa centrifugation kwa 13,000 g kwa 4°C kwa dakika 60. Kwa ajili ya kinga ya Gas1-GFP, kwanza ingiza sampuli kwenye shanga tupu za agarose (ChromoTek) kwenye 4°C kwa saa 1, kisha ingiza kwenye sampuli kwa GFP-Trap_A (ChromoTek) kwenye 4°C kwa saa 3. Shanga zilizo na kinga ya mwili zilioshwa mara tano kwa kutumia TNE yenye 0.2% digoxigenin, zikaondolewa kwa kutumia bafa ya sampuli ya SDS, zikatenganishwa kwenye SDS-PAGE, na kuchambuliwa kwa kutumia kinga ya mwili.
Kama ilivyoelezwa katika (31), uamuzi wa kuunganisha mtambuka ulifanyika kwenye sehemu ya ER iliyoimarishwa. Kwa kifupi, sehemu ya ER iliyoimarishwa iliwekwa kwenye dithiobis ya 0.5 mM (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Marekani; 20°C, dakika 20). Mmenyuko wa kuunganisha mtambuka ulizimwa kwa kuongeza glycine (mkusanyiko wa mwisho wa 50 mM, dakika 5, 20°C).
Kama ilivyoelezwa hapo awali (50), uchambuzi wa MS wa keramide katika aina ya porini na aina ya GhLag1 ulifanywa. Kwa kifupi, seli zilikuzwa hadi awamu ya exponential (vitengo 3 hadi 4 vya OD600/ml) katika YPD kwa 30°C, na seli 25×107 zilivunwa. Umetaboli wao huzimishwa na asidi ya trikloroasetiki. Tumia kiyeyusho cha uchimbaji [ethanoli, maji, etha, pyridine na hidroksidi ya ammonium ya 4.2 N (15:15:5:1:0.018 v/v)] na 1.2 nmoli ya ubora wa ndani wa kawaida wa C17 keramide (860517, Avanti polar lipid)). Tumia kitendanishi cha monomethilamini [methanoli, maji, n-butanoli na myeyusho wa methilamini (4:3:1:5 v/v)] kufanya hidrolisisi laini ya alkali ya dondoo, na kisha tumia n-butanoli iliyojaa maji kuondoa chumvi. Hatimaye, dondoo lilisimamishwa tena katika kiyeyusho chanya [klorofomu/methanoli/maji (2:7:1) + 5 mM amonia asetati] na kuingizwa kwenye spektromita ya wingi. Ufuatiliaji wa mmenyuko mingi (MRM) ulifanywa kwa ajili ya utambuzi na upimaji wa molekuli za sphingolipidi. Spektromita ya uzito wa nne ya TSQ Vantage tertiary quadrupole (Thermo Fisher Scientific) imewekwa na chanzo cha ioni cha roboti cha Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) kwa ajili ya uchambuzi wa lipidi. Nishati ya mgongano imeboreshwa kwa kila kategoria ya kauri. Data ya MS ilipatikana katika hali chanya. Kwa kila nakala ya kibiolojia, ishara ya lipidi ni wastani wa vipimo vitatu huru.
Kama ilivyoelezwa katika (31), seli (800×107) zinazotoa Gas1-GFP zilifanyiwa kinga ya asili. Gas1-GFP iliyosafishwa ilitenganishwa na SDS-PAGE na kuhamishiwa kwenye utando wa polivinylidene floridi (PVDF). Protini ilionyeshwa kwa kuchafua PVDF na amide nyeusi. Bendi ya Gas1-GFP ilikatwa kutoka kwa PVDF na kuoshwa mara 5 na methanoli na mara moja na maji ya kiwango cha kromatografia-MS (LC-MS). Kwa kuangushia utepe wa utando na 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), bafa na 500μl mchanganyiko wa nitriti ya sodiamu 1 M ulioyeyushwa hivi karibuni kwa 37°C kwa saa 3, sehemu ya lipidi hutolewa kutoka Gas1-GFP na kusafishwa. Kutolewa kwa phosphate ceramide ya inosine kati ya glucosamine na inositol (51). Baada ya hapo, kipande cha utando kilioshwa mara nne kwa maji ya kiwango cha LC-MS, kikaushwa kwenye joto la kawaida, na kuhifadhiwa katika angahewa ya nitrojeni kwa -80°C hadi uchanganuzi. Kama udhibiti, sampuli tupu ya utando wa PVDF ilitumika kwa kila jaribio. Mafuta yaliyotolewa kutoka Gas1-GFP kisha yakachambuliwa na MS kama ilivyoelezwa (50). Kwa kifupi, vipande vya PVDF vyenye GPI-lipid vilisimamishwa tena katika kiyeyusho hasi cha ukungu cha 75μl [klorofomu/methanoli (1:2) + 5 mM amonia asetati] na kupitishwa kwa ionization ya electrospray (ESI)-MRM/MS Uchambuzi wa spishi za sphingolipidi (TSQ Vantage). Katika hali hii, data ya MS ilipatikana katika hali hasi ya ioni.
Kama ilivyotajwa hapo awali, sehemu ya lipidi ya nanga ya GPI ilitenganishwa na GPI-AP yenye lebo ya [3H]-inositol (16). Lipidi zilitenganishwa kwa kromatografia yenye safu nyembamba kwa kutumia mfumo wa kiyeyusho (55:45:10 klorofomu-methanoli-0.25% KCl) na kuonyeshwa kwa kutumia FLA-7000 (Fujifilm).
Seli zinazotoa Gas1-GFP (600×107) zilioshwa mara mbili kwa kutumia bafa ya TNE yenye bafa ya TNE, na kuvunjwa kwa shanga za kioo, na kisha kuzungushwa kwa sentrifuge ili kuondoa uchafu wa seli na shanga za kioo. Supernatant kisha ilizungushwa kwa sentrifuge kwa 17,000 g kwa saa 1 kwa 4°C. Kidonge kilioshwa kwa TNE na kuzungushwa kwa 1 U PI-PLC (Invitrogen) katika TNE yenye 0.2% digitalis saponin kwa saa 1 kwa 37°C. Baada ya matibabu ya kimeng'enya, utando uliondolewa kwa sentrifuge kwa 17,000 g kwa 4°C kwa saa 1. Ili kuzuia kinga ya Gas1-GFP, supernatant ilizungushwa kwa GFP-Trap_A (ChromoTek) kwa 4°C usiku kucha. Gas1-GFP iliyosafishwa iliyotenganishwa na SDS-PAGE ilipakwa rangi ya bluu ya Coomassie brilliant. Utepe wa kuchafua wa Gas1-GFP ulikatwa kutoka kwenye kijivu kilichozunguka mfereji wa maji, na kisha baada ya alkylation na iodoacetamide na kupunguza kwa dithiothreitol, usagaji wa ndani ya jeli na trypsin ulifanyika. Kutoa na kukausha peptidi za tryptic na peptidi kwa kutumia GPI-glycans. Peptidi iliyokaushwa iliyeyushwa katika mililita 20 za maji. Choma sehemu (8μl) kwenye LC. Safu wima ya octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; kipenyo cha ndani 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Mkoa wa Aichi, Japani) ilitumika kutenganisha peptidi chini ya hali maalum za gradient. Awamu ya kuhama ni kiyeyusho A (asidi fomik 0.08%) na kiyeyusho B (asidi fomik 0.15% katika asetonitrile 80%). Mfumo wa Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ulitumika kuondoa safu wima na kiyeyusho A ndani ya dakika 55 kwa kiwango cha mtiririko wa 50 μl min-1 kwa dakika 5, na kisha mkusanyiko wa kiyeyusho B uliongezeka hadi 40%., Marekani). Eluate iliingizwa mfululizo kwenye chanzo cha ioni cha ESI, na peptidi za tryptic na peptidi zenye GPI-glycans zilichambuliwa na LTQ Orbitrap XL (spectrometer ya wingi wa ioni mseto ya trap-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Katika usanidi wa MS, volteji ya chanzo cha kapilari iliwekwa hadi 4.5 kV, na halijoto ya kapilari ya uhamisho iliwekwa kwenye 300°C. Volti ya kapilari na volteji ya lenzi ya mirija iliwekwa hadi 15 V na 50 V, mtawalia. Data ya MS ilipatikana katika hali ya ioni chanya (azimio la 60,000; usahihi wa uzito wa sehemu 10 kwa milioni) katika kiwango cha uzito cha uwiano wa uzito/chaji wa 300/m/z (m/z) 3000. Data ya MS/MS inapatikana kupitia mtego wa ioni katika LTQ Orbitrap XL [tarakimu 3 za kwanza ambazo data inategemea, kutenganishwa kunakosababishwa na mgongano (CID)].
Uigaji wa MD ulifanywa kwa kutumia programu ya GROMACS (52) na uwanja wa nguvu wa MARTINI 2 (53-55). Kisha, Mjenzi wa Utando wa CHARMM GUI (56, 57) alitumika kujenga safu mbili iliyo na dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) na Cer C18 au DOPC na Cer C26. Topolojia na viwianishi vya Cer C26 vinatokana na DXCE kwa kuondoa shanga za ziada kutoka kwa mkia wa sphingosine. Tumia mchakato ulioelezwa hapa chini kusawazisha safu mbili na kuiendesha, kisha tumia viwianishi vya mwisho vya mfumo kujenga mfumo ulio na Emp24. Kikoa cha transmembrane cha chachu ya Emp24 (mabaki 173 hadi 193) kilijengwa kama α-helix kwa kutumia muundo wa molekuli wa zana ya Visual MD (VMD) (58). Kisha, baada ya kuondoa lipidi zinazoingiliana, protini ilipakwa chembe chembe na kuingizwa kwenye safu mbili kwa kutumia CHARMM GUI. Mfumo wa mwisho una 1202 DOPC na 302 Cer C26 au 1197 DOPC na 295 Cer C18 na Emp24. Ionishe mfumo hadi mkusanyiko wa 0.150M. Nakala nne huru zilitengenezwa kwa ajili ya michanganyiko miwili ya safu mbili.
Tabaka la lipidi husawazishwa kwa kutumia mchakato wa CHARMM GUI, ambao unahusisha kupunguza na kisha kusawazisha hatua 405,000, ambapo vikwazo vya nafasi hupunguzwa na kuondolewa polepole, na hatua ya muda huongezwa kutoka 0.005 ps hadi 0.02 ps. Baada ya kusawazisha, hutoa µs 6 zenye hatua ya muda ya 0.02 ps. Baada ya kuingiza Emp24, tumia mchakato uleule wa CHARMM GUI ili kupunguza na kusawazisha mfumo, na kisha uendelee kwa sekunde 8 katika uzalishaji.
Kwa mifumo yote, wakati wa mchakato wa kusawazisha, shinikizo hudhibitiwa na barostat ya Berendsen (59), na wakati wa mchakato wa uzalishaji, shinikizo hudhibitiwa na barostat ya Parrinello-Rahman (60). Katika visa vyote, shinikizo la wastani ni baa 1 na mpango wa kuunganisha shinikizo la nusu-isotropiki hutumiwa. Katika mchakato wa usawa na uzalishaji, thermostat (61) yenye urekebishaji wa kasi hutumika kuunganisha halijoto ya protini, lipidi na chembe za kiyeyusho mtawalia. Wakati wa operesheni nzima, halijoto inayolengwa ni 310K. Mwingiliano usio na dhamana huhesabiwa kwa kutoa orodha ya kuoanisha kwa kutumia mpango wa Verlet wenye uvumilivu wa bafa ya 0.005. Neno la Coulomb huhesabiwa kwa kutumia sehemu ya mmenyuko na umbali wa kukatwa wa 1.1 nm. Neno la Vander Waals hutumia mpango wa kukatwa wenye umbali wa kukatwa wa 1.1 nm, na mpango wa kukatwa wa Verlet hutumika kwa uwezekano wa kuteleza (62).
Kwa kutumia VMD, urefu wa wimbi kati ya shanga za fosfeti za DOPC au shanga za kauri AM1 na protini ni 0.7 nm, na idadi ya lipidi zinazoingiliana na protini huhesabiwa. Kulingana na fomula ifuatayo, hesabu kipengele cha uboreshaji wa upungufu (DE) kama ilivyo katika (63): kipengele cha DE = (kiasi cha lipidi zote katika protini 0.7) katika protini 0.7 (kiasi cha Cer katika lipidi zote)
Thamani iliyoripotiwa inapatikana kama wastani, na pau za hitilafu ni nakala nne huru za SE. Umuhimu wa kitakwimu wa kipengele cha DE huhesabiwa kwa jaribio la t [(wastani wa kipengele cha DE-1)/SE]. Kokotoa thamani ya P kutoka kwa usambazaji wa mkia mmoja.
Zana ya GROMACS ilitumika kukokotoa ramani ya msongamano wa pembeni ya 2D ya mfumo ulio na Emp24 ndani ya ns 250 za mwisho za alama. Ili kupata ramani ya uboreshaji/upungufu wa kauri, ramani ya msongamano wa Cer imegawanywa na jumla ya ramani ya Cer na DOPC, na kisha kugawanywa na mkusanyiko wa Cer mwilini. Kipimo sawa cha ramani ya rangi kinatumika.
Kwa nyenzo za ziada kwa makala haya, tafadhali tazama http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Hii ni makala ya ufikiaji wazi inayosambazwa chini ya masharti ya Leseni ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, ambayo inaruhusu matumizi, usambazaji na uzandikishaji katika njia yoyote, mradi tu matumizi ya mwisho si kwa faida ya kibiashara na msingi ni kwamba kazi ya awali ni sahihi. Marejeleo.
Kumbuka: Tunakuomba tu utoe anwani yako ya barua pepe ili mtu unayempendekeza kwenye ukurasa ajue kwamba unataka aone barua pepe hiyo na kwamba si barua taka. Hatutarekodi anwani zozote za barua pepe.
Swali hili linatumika kujaribu kama wewe ni mgeni na kuzuia uwasilishaji wa barua taka kiotomatiki.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lineho Lopero, Ana Maria Perez -Lineho Lopero Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Upigaji picha wa wakati halisi wa 3D wenye ubora wa juu unaonyesha umuhimu wa urefu wa mnyororo wa kauri kwa ajili ya kupanga protini katika maeneo teule ya kutoa matokeo.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lineho Lopero, Ana Maria Perez -Lineho Lopero Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Upigaji picha wa wakati halisi wa 3D wenye ubora wa juu unaonyesha umuhimu wa urefu wa mnyororo wa kauri kwa ajili ya kupanga protini katika maeneo teule ya kutoa matokeo.
©2020 Chama cha Marekani cha Kuendeleza Sayansi. haki zote zimehifadhiwa. AAAS ni mshirika wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef na COUNTER. SayansiMaendeleo ISSN 2375-2548.