Hapo awali tuliripoti kwamba viwango vya seramu vya tryptophan metabolite indole-3-propionic acid (IPA) inayotokana na utumbo ni vya chini kwa wagonjwa walio na fibrosis ya ini. Katika utafiti huu, tulichunguza transcriptome na methylome ya DNA katika ini zilizonenepa kuhusiana na viwango vya IPA ya seramu, pamoja na jukumu la IPA katika kuchochea uanzishaji wa phenotypic wa seli za stellate ya ini (HSCs) ndani ya vitro.
Utafiti huo ulijumuisha wagonjwa 116 wanene wasio na kisukari aina ya 2 (T2DM) (umri wa miaka 46.8 ± 9.3; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) waliofanyiwa upasuaji wa bariatric katika Kituo cha Upasuaji cha Kuopio Bariatric (KOBS). Viwango vya IPA vinavyozunguka vilipimwa kwa kutumia spectrometry ya kioevu ya chromatografia-mass (LC-MS), uchambuzi wa transcriptome ya ini ulifanywa kwa kutumia mfuatano wa jumla wa RNA, na uchambuzi wa methylation ya DNA ulifanywa kwa kutumia Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Seli za stellate ya ini ya binadamu (LX-2) zilitumika kwa majaribio ya ndani ya vitro.
Viwango vya IPA katika seramu vilihusiana na usemi wa jeni zinazohusika katika njia za apoptotiki, mitofaji, na maisha marefu katika ini. Jeni la AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) lilikuwa jeni linaloingiliana kwa wingi na kubwa zaidi katika nakala ya ini na wasifu wa methylation ya DNA. Matibabu ya IPA yalisababisha apoptosis, kupungua kwa kupumua kwa mitochondria, na kubadilisha umbo la seli na mienendo ya mitochondria kwa kurekebisha usemi wa jeni zinazojulikana kudhibiti fibrosis, apoptosis, na kuishi kwa seli za LX-2.
Kwa pamoja, data hizi zinaunga mkono kwamba IPA ina athari zinazowezekana za matibabu na inaweza kusababisha apoptosis na kuhamisha phenotype ya HSC kuelekea hali isiyofanya kazi, na hivyo kupanua uwezekano wa kuzuia fibrosis ya ini kwa kuingilia uanzishaji wa HSC na umetaboli wa mitochondrial.
Kuenea kwa unene kupita kiasi na ugonjwa wa kimetaboliki kumehusishwa na ongezeko la matukio ya ugonjwa wa ini wenye mafuta unaohusishwa na kimetaboliki (MASLD); ugonjwa huu huathiri 25% hadi 30% ya idadi ya watu kwa ujumla [1]. Matokeo kuu ya etiolojia ya MASLD ni fibrosis ya ini, mchakato unaobadilika unaoonyeshwa na mkusanyiko unaoendelea wa matrix ya nje ya seli ya nyuzinyuzi (ECM) [2]. Seli kuu zinazohusika na fibrosis ya ini ni seli za stellate ya ini (HSCs), ambazo zinaonyesha aina nne zinazojulikana: tulivu, zilizoamilishwa, zisizoamilishwa, na zilizokomaa [3, 4]. HSC zinaweza kuamilishwa na kubadilika kutoka kwa umbo la tulivu hadi seli zinazoongezeka kama fibroblast zenye mahitaji makubwa ya nishati, pamoja na ongezeko la usemi wa actin laini ya misuli ya α (α-SMA) na kolajeni ya aina ya I (Col-I) [5, 6]. Wakati wa kugeuzwa kwa fibrosis ya ini, HSC zilizoamilishwa huondolewa kupitia apoptosis au kuzima. Michakato hii inajumuisha kupunguza udhibiti wa jeni zinazosababisha fibrojeni na urekebishaji wa jeni za prosurvival (kama vile njia za kuashiria za NF-κB na PI3K/Akt) [7, 8], pamoja na mabadiliko katika mienendo na utendakazi wa mitochondrial [9].
Viwango vya seramu vya metabolite ya tryptophan indole-3-propionic acid (IPA), inayozalishwa kwenye utumbo, vimeonekana kupungua katika magonjwa ya kimetaboliki ya binadamu ikiwa ni pamoja na MASLD [10-13]. IPA inahusishwa na ulaji wa nyuzinyuzi katika lishe, inajulikana kwa athari zake za antioxidant na kupambana na uchochezi, na hupunguza phenotype ya steatohepatitis isiyo na kileo (NASH) inayosababishwa na lishe katika mwili na katika vitro [11-14]. Ushahidi fulani unatoka katika utafiti wetu uliopita, ambao ulionyesha kuwa viwango vya IPA katika seramu vilikuwa chini kwa wagonjwa wenye fibrosis ya ini kuliko kwa wagonjwa wanene wasio na fibrosis ya ini katika Utafiti wa Upasuaji wa Kuopio Bariatric (KOBS). Zaidi ya hayo, tulionyesha kuwa matibabu ya IPA yanaweza kupunguza usemi wa jeni ambazo ni alama za kitamaduni za kushikamana kwa seli, uhamiaji wa seli na uanzishaji wa seli shina za hematopoietic katika mfumo wa seli shina za hepatic stellate ya binadamu (LX-2) na ni metabolite inayoweza kulinda hepato [15]. Hata hivyo, bado haijulikani jinsi IPA inavyosababisha kurudi nyuma kwa fibrosis ya ini kwa kuamsha apoptosis ya HSC na bioenergetics ya mitochondrial.
Hapa, tunaonyesha kwamba IPA ya seramu inahusishwa na usemi wa jeni zilizotajiriwa katika apoptosis, mitofagia, na njia za maisha marefu katika ini la watu wenye ugonjwa wa kisukari wanene lakini usio wa aina ya 2 (KOBS). Zaidi ya hayo, tuligundua kuwa IPA inaweza kusababisha uondoaji na uharibifu wa seli shina za hematopoietic zilizoamilishwa (HSCs) kupitia njia ya kusimamisha. Matokeo haya yanaonyesha jukumu jipya kwa IPA, na kuifanya kuwa lengo linalowezekana la matibabu ili kukuza urejesho wa fibrosis ya ini.
Utafiti uliopita katika kundi la KOBS ulionyesha kuwa wagonjwa wenye fibrosis ya ini walikuwa na viwango vya chini vya IPA vinavyozunguka ikilinganishwa na wagonjwa wasio na fibrosis ya ini [15]. Ili kuondoa athari inayoweza kutatanisha ya kisukari cha aina ya 2, tuliwaajiri wagonjwa 116 wanene bila kisukari cha aina ya 2 (wastani wa umri ± SD: miaka 46.8 ± 9.3; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Jedwali 1) kutoka kwa utafiti unaoendelea wa KOBS kama kundi la utafiti [16]. Washiriki wote walitoa idhini iliyoandikwa na itifaki ya utafiti iliidhinishwa na Kamati ya Maadili ya Hospitali ya Kaunti ya North Savo kwa mujibu wa Azimio la Helsinki (54/2005, 104/2008 na 27/2010).
Sampuli za biopsy ya ini zilipatikana wakati wa upasuaji wa bariatric na kupimwa kihistolojia na wataalamu wa magonjwa wenye uzoefu kulingana na vigezo vilivyoelezwa hapo awali [17, 18]. Vigezo vya tathmini vimefupishwa katika Jedwali la Ziada S1 na vimeelezewa hapo awali [19].
Sampuli za seramu ya kufunga zilichambuliwa kwa kutumia spektrometri ya chromatografia ya kioevu isiyolengwa (LC-MS) kwa ajili ya uchambuzi wa metabolomiki (n = 116). Sampuli zilichambuliwa kwa kutumia mfumo wa UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Ujerumani) kama ilivyoelezwa hapo awali19. Utambuzi wa pombe ya isopropili (IPA) ulitegemea muda wa kuhifadhi na kulinganisha wigo wa MS/MS na viwango safi. Kiwango cha ishara ya IPA (eneo la kilele) kilizingatiwa katika uchambuzi wote zaidi [20].
Mfuatano wa RNA ya ini zima ulifanywa kwa kutumia Illumina HiSeq 2500 na data ilichakatwa mapema kama ilivyoelezwa hapo awali [19, 21, 22]. Tulifanya uchanganuzi wa usemi tofauti uliolengwa wa nakala zinazoathiri utendaji kazi/biogenesis ya mitochondrial kwa kutumia jeni za 1957 zilizochaguliwa kutoka kwenye hifadhidata ya MitoMiner 4.0 [23]. Uchanganuzi wa methylation ya DNA ya ini ulifanywa kwa kutumia Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, Marekani) kwa kutumia mbinu ile ile kama ilivyoelezwa hapo awali [24, 25].
Seli za stellate za ini ya binadamu (LX-2) zilitolewa kwa hisani na Prof. Stefano Romeo na zilikuzwa na kudumishwa katika hali ya DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Ili kuchagua kipimo cha kufanya kazi cha IPA, seli za LX-2 zilitibiwa kwa viwango tofauti vya IPA (10 μM, 100 μM na 1 mM; Sigma, 220027) katika hali ya DMEM/F12 kwa saa 24. Zaidi ya hayo, ili kuchunguza uwezo wa IPA kuzima HSC, seli za LX-2 zilitibiwa pamoja na 5 ng/ml TGF-β1 (mifumo ya R&D, 240-B-002/CF) na 1 mM IPA katika hali ya DMEM isiyo na seramu kwa saa 24. Kwa vidhibiti vya magari vinavyolingana, 4 nM HCL yenye 0.1% BSA ilitumika kwa ajili ya matibabu ya TGF-β1 na 0.05% DMSO ilitumika kwa ajili ya matibabu ya IPA, na zote mbili zilitumika pamoja kwa ajili ya matibabu mchanganyiko.
Apoptosis ilipimwa kwa kutumia Kifaa cha Kugundua Apoptosis cha FITC Annexin V chenye 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, Marekani, Cat# 640922) kulingana na maagizo ya mtengenezaji. Kwa ufupi, LX-2 (seli 1 × 105/kisima) zilikuzwa usiku kucha katika sahani za visima 12 na kisha kutibiwa kwa dozi nyingi za IPA au IPA na TGF-β1. Siku iliyofuata, seli zinazoelea na zinazoshikamana zilikusanywa, zikasafishwa, zikaoshwa na PBS, zikasimamishwa tena kwenye bafa ya kufunga ya Annexin V, na kuingizwa na FITC-Annexin V na 7-AAD kwa dakika 15.
Mitochondria katika seli hai zilitiwa rangi kwa ajili ya shughuli za oksidi kwa kutumia Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Kwa majaribio ya MTR, seli za LX-2 ziliwekwa kwenye msongamano sawa na IPA na TGF-β1. Baada ya saa 24, seli hai ziliwekwa kwenye trypsini, zikaoshwa na PBS, na kisha kuwekwa kwenye 100 μM MTR katika hali ya hewa isiyo na seramu kwa 37 °C kwa dakika 20 kama ilivyoelezwa hapo awali [26]. Kwa uchambuzi wa mofolojia ya seli hai, ukubwa wa seli na ugumu wa saitoplazimu vilichambuliwa kwa kutumia vigezo vya forward scatter (FSC) na side scatter (SSC), mtawalia.
Data zote (matukio 30,000) zilipatikana kwa kutumia NovoCyte Quanteon (Agilent) na kuchanganuliwa kwa kutumia programu ya NovoExpress® 1.4.1 au FlowJo V.10.
Kiwango cha matumizi ya oksijeni (OCR) na kiwango cha asidi ya nje ya seli (ECAR) vilipimwa kwa wakati halisi kwa kutumia Kichambuzi cha Flux ya Seahorse Extracellular (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) kilicho na Mkazo wa Seahorse XF Cell Mito kulingana na maagizo ya mtengenezaji. Kwa ufupi, seli 2 × 104 LX-2/kisima zilipandwa kwenye sahani za uundaji wa seli za XF96. Baada ya kuangushwa usiku kucha, seli zilitibiwa na isopropanol (IPA) na TGF-β1 (Mbinu za Nyongeza 1). Uchambuzi wa data ulifanywa kwa kutumia programu ya Seahorse XF Wave, ambayo inajumuisha Jenereta ya Ripoti ya Mtihani wa Nishati ya Seli ya Seahorse XF. Kutokana na hili, Kielelezo cha Afya cha Bioenergetic (BHI) kilihesabiwa [27].
Jumla ya RNA iliandikwa katika cDNA. Kwa mbinu maalum, tazama marejeleo [15]. Viwango vya mRNA ya ribosomal asidi ya binadamu ya 60S P0 (RPLP0) na saiklofilini A1 (PPIA) vilitumika kama vidhibiti vya jeni. Mfumo wa PCR wa QuantStudio 6 pro Real-Time (Thermo Fisher, Landsmeer, Uholanzi) ulitumika pamoja na Kitengo cha Mix Master Mix cha TaqMan™ Fast Advanced (Applied Biosystems) au Kitengo cha Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), na usemi wa jeni unaohusiana ulihesabiwa kwa kutumia vigezo vya mzunguko wa thamani ya Ct kulinganisha (ΔΔCt) na mbinu ya ∆∆Ct. Maelezo ya vitangulizi yametolewa katika Majedwali ya Ziada S2 na S3.
DNA ya nyuklia (ncDNA) na DNA ya mitochondrial (mtDNA) zilitolewa kwa kutumia kifaa cha DNeasy blood and tissue (Qiagen) kama ilivyoelezwa hapo awali [28]. Kiasi cha mtDNA kilihesabiwa kwa kuhesabu uwiano wa kila eneo lengwa la mtDNA kwa wastani wa kijiometri wa maeneo matatu ya DNA ya nyuklia (mtDNA/ncDNA), kama ilivyoelezwa katika Mbinu za Ziada 2. Maelezo ya vitangulizi vya mtDNA na ncDNA yametolewa katika Jedwali la Ziada S4.
Seli hai zilipakwa rangi ya Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ili kuibua mitandao ya mitochondria kati ya seli na ndani ya seli. Seli za LX-2 (seli 1 × 104/kisima) zilikuzwa kwenye slaidi za kioo katika sahani za utamaduni zenye chini ya kioo zinazolingana (Ibidi GmbH, Martinsried, Ujerumani). Baada ya saa 24, seli hai za LX-2 zilipakwa rangi ya 100 μM MTR kwa dakika 20 kwa 37 °C na viini vya seli vilipakwa rangi ya DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) kama ilivyoelezwa hapo awali [29]. Mitandao ya mitochondria ilionyeshwa kwa kutumia darubini iliyogeuzwa ya Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Ujerumani) iliyo na moduli ya confocal ya Zeiss LSM 800 kwa 37 °C katika angahewa yenye unyevunyevu na 5% CO2 kwa kutumia lengo la 63×NA 1.3. Tulipata picha kumi za mfululizo wa Z kwa kila aina ya sampuli. Kila mfululizo wa Z una sehemu 30, kila moja ikiwa na unene wa 9.86 μm. Kwa kila sampuli, picha za nyanja kumi tofauti za mwonekano zilipatikana kwa kutumia programu ya ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Ujerumani), na uchambuzi wa mofolojia ya mitochondrial ulifanywa kwa kutumia programu ya ImageJ (v1.54d) [30, 31] kulingana na vigezo vilivyoainishwa katika Mbinu za Ziada 3.
Seli zilirekebishwa na 2% glutaraldehyde katika bafa ya fosfeti ya 0.1 M, ikifuatiwa na kurekebishwa na 1% ya suluhisho la tetroxide ya osmium (Sigma Aldrich, MO, Marekani), zikakaushwa polepole na asetoni (Merck, Darmstadt, Ujerumani), na hatimaye zikaingizwa kwenye resini ya epoksi. Sehemu nyembamba sana zilitayarishwa na kupakwa rangi na 1% ya asetiki ya uranyl (Merck, Darmstadt, Ujerumani) na 1% ya citrate ya risasi (Merck, Darmstadt, Ujerumani). Picha za kimuundo zilipatikana kwa kutumia darubini ya elektroni ya upitishaji ya JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japani) kwa volteji ya kasi ya 80 kV.
Mofolojia ya seli za LX-2 zilizotibiwa na IPA kwa saa 24 ilichambuliwa kwa kutumia hadubini ya utofautishaji wa awamu katika ukuzaji wa mara 50 kwa kutumia hadubini ya mwanga iliyogeuzwa ya Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 na AxioCam MRm, Jena, Ujerumani).
Data ya kimatibabu ilionyeshwa kama wastani ± kupotoka kwa kawaida au wastani (kiwango cha kati ya robo: IQR). Uchambuzi wa njia moja wa tofauti (vigezo vinavyoendelea) au jaribio la χ² (vigezo vya kategoria) ulitumika kulinganisha tofauti kati ya vikundi vitatu vya utafiti. Kiwango cha chanya cha uwongo (FDR) kilitumika kusahihisha majaribio mengi, na jeni zenye FDR < 0.05 zilizingatiwa kuwa muhimu kitakwimu. Uchambuzi wa uwiano wa Spearman ulitumika kuoanisha methylation ya DNA ya CpG na kiwango cha ishara ya IPA, huku thamani za p za kawaida (p < 0.05) zikiripotiwa.
Uchambuzi wa njia ulifanywa kwa kutumia zana ya uchambuzi wa seti ya jeni inayotegemea wavuti (WebGestalt) kwa nakala 268 (nominal p < 0.01), nakala 119 zinazohusiana na mitochondria (nominal p < 0.05), na CpG 4350 kati ya nakala 3093 za ini ambazo zilihusishwa na viwango vya IPA vinavyozunguka kwenye seramu. Zana ya Venny DB (toleo la 2.1.0) inayopatikana kwa uhuru ilitumika kupata jeni zinazoingiliana, na StringDB (toleo la 11.5) ilitumika kuibua mwingiliano wa protini na protini.
Kwa jaribio la LX-2, sampuli zilijaribiwa kwa uhalisia kwa kutumia jaribio la D'Agostino-Pearson. Data zilipatikana kutoka kwa angalau nakala tatu za kibiolojia na kufanyiwa ANOVA ya njia moja na jaribio la Bonferroni baada ya hoc. Thamani ya p ya chini ya 0.05 ilizingatiwa kuwa muhimu kitakwimu. Data zinawasilishwa kama wastani ± SD, na idadi ya majaribio imeonyeshwa katika kila mchoro. Uchambuzi na grafu zote zilifanywa kwa kutumia programu ya takwimu ya GraphPad Prism 8 kwa Windows (GraphPad Software Inc., toleo la 8.4.3, San Diego, Marekani).
Kwanza, tulichunguza uhusiano wa viwango vya IPA katika seramu na nakala za ini, mwili mzima, na mitochondria. Katika wasifu kamili wa nakala, jeni yenye nguvu zaidi inayohusiana na viwango vya IPA katika seramu ilikuwa MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; protini kinase 3 inayoamilishwa na mitogen inayoamilishwa na protini kinase); katika wasifu wa nakala unaohusiana na mitochondria, jeni yenye nguvu zaidi inayohusiana ilikuwa AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Faili ya ziada 1 na faili ya ziada 2).
Kisha tukachambua nakala za kimataifa (n = 268; p < 0.01) na nakala zinazohusiana na mitochondria (n = 119; p < 0.05), hatimaye tukatambua apoptosis kama njia muhimu zaidi ya kisheria (p = 0.0089). Kwa nakala za mitochondria zinazohusiana na viwango vya IPA vya seramu, tulizingatia apoptosis (FDR = 0.00001), mitofaji (FDR = 0.00029), na njia za kuashiria TNF (FDR = 0.000006) (Mchoro 1A, Jedwali 2, na Takwimu za Ziada 1A-B).
Uchambuzi unaoingiliana wa nakala za kimataifa, zinazohusiana na mitochondria, na methylation ya DNA katika ini la binadamu kwa kushirikiana na viwango vya IPA vya seramu. A inawakilisha nakala 268 za kimataifa, nakala 119 zinazohusiana na mitochondria, na nakala zenye methili za DNA ambazo zimepangwa kwenye maeneo 3092 ya CpG yanayohusiana na viwango vya IPA vya seramu (thamani za p < 0.01 kwa nakala za kimataifa na DNA yenye methili, na thamani za p < 0.05 kwa nakala za mitochondria). Nakala kuu zinazoingiliana zinaonyeshwa katikati (AKT1 na YKT6). B Ramani ya mwingiliano wa jeni 13 zenye alama ya juu zaidi ya mwingiliano (0.900) na jeni zingine ilijengwa kutoka kwa jeni 56 zinazoingiliana (eneo la mstari mweusi) ambazo zilihusishwa kwa kiasi kikubwa na viwango vya IPA vya seramu kwa kutumia zana ya mtandaoni ya StringDB. Kijani: Jeni zilizopangwa kwenye sehemu ya seli ya Gene Ontology (GO): mitochondria (GO:0005739). AKT1 ni protini yenye alama ya juu zaidi (0.900) kwa mwingiliano na protini zingine kulingana na data (kulingana na uchimbaji wa maandishi, majaribio, hifadhidata, na usemi-mshikamano). Nodi za mtandao zinawakilisha protini, na kingo zinawakilisha miunganisho kati ya protini.
Kwa kuwa metaboliti za microbiota za utumbo zinaweza kudhibiti muundo wa epigenetic kupitia methylation ya DNA [32], tulichunguza ikiwa viwango vya IPA vya seramu vilihusishwa na methylation ya DNA ya ini. Tuligundua kuwa maeneo mawili makubwa ya methylation yanayohusiana na viwango vya IPA vya seramu yalikuwa karibu na eneo la 3 lenye proline-serine nyingi (C19orf55) na familia ya protini ya mshtuko wa joto B (ndogo) mwanachama 6 (HSPB6) (Faili ya ziada 3). methylation ya DNA ya 4350 CpG (p < 0.01) ilihusiana na viwango vya IPA vya seramu na ilitajiriwa katika njia za udhibiti wa maisha marefu (p = 0.006) (Mchoro 1A, Jedwali 2, na Mchoro wa Nyongeza 1C).
Ili kuelewa mifumo ya kibiolojia inayozingatia uhusiano kati ya viwango vya IPA vya seramu, nakala za kimataifa, nakala zinazohusiana na mitochondria, na methylation ya DNA katika ini la binadamu, tulifanya uchambuzi wa mwingiliano wa jeni zilizotambuliwa katika uchambuzi wa njia uliopita (Mchoro 1A). Matokeo ya uchambuzi wa uboreshaji wa njia ya jeni 56 zinazoingiliana (ndani ya mstari mweusi katika Mchoro 1A) yalionyesha kuwa njia ya apoptosis (p = 0.00029) ilionyesha jeni mbili zinazofanana na uchambuzi huo tatu: AKT1 na YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), kama inavyoonyeshwa kwenye mchoro wa Venn (Mchoro wa Nyongeza 2 na Mchoro 1A). Cha kufurahisha, tuligundua kuwa AKT1 (cg19831386) na YKT6 (cg24161647) zilihusiana vyema na viwango vya IPA vya seramu (Faili la Ziada 3). Ili kutambua mwingiliano unaowezekana wa protini kati ya bidhaa za jeni, tulichagua jeni 13 zenye alama ya juu zaidi ya eneo la kawaida (0.900) kati ya jeni 56 zinazoingiliana kama pembejeo na tukaunda ramani ya mwingiliano. Kulingana na kiwango cha kujiamini (kujiamini kwa pembezoni), jeni la AKT1 lenye alama ya juu zaidi (0.900) lilikuwa juu (Mchoro 1B).
Kulingana na uchambuzi wa njia, tuligundua kuwa apoptosis ilikuwa njia kuu, kwa hivyo tulichunguza ikiwa matibabu ya IPA yangeathiri apoptosis ya HSCs ndani ya vitro. Hapo awali tulionyesha kuwa vipimo tofauti vya IPA (10 μM, 100 μM, na 1 mM) havikuwa na sumu kwa seli za LX-2 [15]. Utafiti huu ulionyesha kuwa matibabu ya IPA kwa 10 μM na 100 μM yaliongeza idadi ya seli zinazoweza kuishi na zenye necrotic. Hata hivyo, ikilinganishwa na kundi la udhibiti, uwezo wa seli kuishi ulipungua kwa 1 mM mkusanyiko wa IPA, huku kiwango cha necrosis ya seli kikibaki bila kubadilika (Mchoro 2A, B). Kisha, ili kupata mkusanyiko bora wa kusababisha apoptosis katika seli za LX-2, tulijaribu 10 μM, 100 μM, na 1 mM IPA kwa saa 24 (Mchoro 2A-E na Mchoro wa Nyongeza 3A-B). Cha kufurahisha ni kwamba, IPA 10 μM na 100 μM zilipunguza kiwango cha apoptosis (%), hata hivyo, IPA 1 mM iliongeza kiwango cha apoptosis ya marehemu na kiwango cha apoptosis (%) ikilinganishwa na udhibiti na kwa hivyo ilichaguliwa kwa majaribio zaidi (Michoro 2A–D).
IPA husababisha apoptosis ya seli za LX-2. Mbinu ya Annexin V na 7-AAD ya kuchafua mara mbili ilitumika kupima kiwango cha apoptotiki na mofolojia ya seli kwa kutumia saitometri ya mtiririko. Seli za BA ziliwekwa ndani ya incubation na 10 μM, 100 μM na 1 mM IPA kwa saa 24 au na F–H TGF-β1 (5 ng/ml) na 1 mM IPA katika hali isiyo na seramu kwa saa 24. A: seli hai (Kiambatisho V -/ 7AAD-); B: seli za necrotic (Kiambatisho V -/ 7AAD+); C, F: mapema (Kiambatisho V +/ 7AAD-); D, G: marehemu (Kiambatisho V+/7AAD+.); E, H: asilimia ya jumla ya seli za apoptotiki za mapema na za marehemu katika kiwango cha apoptotiki (%). Data zinaonyeshwa kama wastani ± SD, n = majaribio 3 huru. Ulinganisho wa takwimu ulifanywa kwa kutumia ANOVA ya njia moja na jaribio la baada ya hoc la Bonferroni. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Kama tulivyoonyesha hapo awali, 5 ng/ml TGF-β1 inaweza kusababisha uanzishaji wa HSC kwa kuongeza usemi wa jeni za alama za kitamaduni [15]. Seli za LX-2 zilitibiwa na 5 ng/ml TGF-β1 na 1 mM IPA pamoja (Mchoro 2E–H). Matibabu ya TGF-β1 hayakubadilisha kiwango cha apoptosis, hata hivyo, matibabu ya pamoja ya IPA yaliongeza kiwango cha apoptosis ya marehemu na apoptosis (%) ikilinganishwa na matibabu ya TGF-β1 (Mchoro 2E–H). Matokeo haya yanaonyesha kuwa 1 mM IPA inaweza kukuza apoptosis katika seli za LX-2 bila kujali uanzishaji wa TGF-β1.
Tulichunguza zaidi athari ya IPA kwenye upumuaji wa mitochondria katika seli za LX-2. Matokeo yalionyesha kuwa IPA ya mM 1 ilipunguza vigezo vya kiwango cha matumizi ya oksijeni (OCR): upumuaji usio wa mitochondria, upumuaji wa msingi na wa juu zaidi, uvujaji wa protoni na uzalishaji wa ATP ikilinganishwa na kundi la udhibiti (Mchoro 3A, B), huku kiashiria cha afya cha kibiolojia (BHI) hakikubadilika.
IPA hupunguza upumuaji wa mitochondrial katika seli za LX-2. Mkunjo wa upumuaji wa mitochondrial (OCR) unawasilishwa kama vigezo vya upumuaji wa mitochondrial (upumuaji usio wa mitochondrial, upumuaji wa msingi, upumuaji wa juu zaidi, uvujaji wa protoni, uzalishaji wa ATP, SRC na BHI). Seli A na B ziliwekwa ndani ya incubation na 10 μM, 100 μM na 1 mM IPA kwa saa 24, mtawalia. Seli C na D ziliwekwa ndani ya incubation na TGF-β1 (5 ng/ml) na 1 mM IPA katika hali isiyo na seramu kwa saa 24, mtawalia. Vipimo vyote vilirekebishwa kwa kiwango cha DNA kwa kutumia kifaa cha CyQuant. BHI: index ya afya ya bioenergetic; SRC: uwezo wa hifadhi ya upumuaji; OCR: kiwango cha matumizi ya oksijeni. Data zinawasilishwa kama wastani ± kupotoka kwa kawaida (SD), n = majaribio 5 huru. Ulinganisho wa takwimu ulifanywa kwa kutumia jaribio la ANOVA la njia moja na jaribio la Bonferroni baada ya hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; na ***p < 0.001
Ili kupata uelewa wa kina zaidi wa athari za IPA kwenye wasifu wa kibiolojia wa seli za LX-2 zilizoamilishwa na TGF-β1, tulichambua fosforasi ya oksidi ya mitochondrial kwa kutumia OCR (Mchoro 3C, D). Matokeo yalionyesha kuwa matibabu ya TGF-β1 yanaweza kupunguza kiwango cha juu cha upumuaji, uwezo wa hifadhi ya upumuaji (SRC) na BHI ikilinganishwa na kundi la udhibiti (Mchoro 3C, D). Zaidi ya hayo, matibabu mchanganyiko yalipunguza upumuaji wa msingi, uvujaji wa protoni na uzalishaji wa ATP, lakini SRC na BHI zilikuwa juu zaidi kuliko zile zilizotibiwa na TGF-β1 (Mchoro 3C, D).
Pia tulifanya "Jaribio la Fenotype ya Nishati ya Seli" lililotolewa na programu ya Seahorse (Mchoro wa Nyongeza 4A–D). Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro wa Nyongeza 3B, uwezo wa kimetaboliki wa OCR na ECAR ulipungua baada ya matibabu ya TGF-β1, hata hivyo, hakuna tofauti iliyoonekana katika vikundi vya matibabu ya mchanganyiko na IPA ikilinganishwa na kikundi cha udhibiti. Zaidi ya hayo, viwango vya msingi na vya msongo wa mawazo vya OCR vilipungua baada ya matibabu ya mchanganyiko na IPA ikilinganishwa na kikundi cha udhibiti (Mchoro wa Nyongeza 4C). Cha kufurahisha, muundo kama huo ulionekana na tiba mchanganyiko, ambapo hakuna mabadiliko katika viwango vya msingi na vya msongo wa mawazo vya ECAR yaliyoonekana ikilinganishwa na matibabu ya TGF-β1 (Mchoro wa Nyongeza 4C). Katika HSC, kupungua kwa fosforasi ya oksidi ya mitochondrial na uwezo wa matibabu mchanganyiko kurejesha SCR na BHI baada ya kuathiriwa na matibabu ya TGF-β1 hakukubadilisha uwezo wa kimetaboliki (OCR na ECAR). Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kwamba IPA inaweza kupunguza bioenergetics katika HSCs, ikidokeza kwamba IPA inaweza kusababisha wasifu mdogo wa nishati ambao hubadilisha phenotype ya HSC kuelekea kuzima (Mchoro wa Nyongeza 4D).
Athari ya IPA kwenye mienendo ya mitochondria ilichunguzwa kwa kutumia kipimo cha pande tatu cha mofolojia ya mitochondria na miunganisho ya mtandao pamoja na madoa ya MTR (Mchoro 4 na Mchoro wa Nyongeza 5). Mchoro 4 unaonyesha kwamba, ikilinganishwa na kundi la udhibiti, matibabu ya TGF-β1 yalipunguza eneo la wastani la uso, idadi ya tawi, urefu wa jumla wa tawi, na idadi ya makutano ya tawi (Mchoro 4A na B) na kubadilisha uwiano wa mitochondria kutoka mofolojia ya duara hadi ya kati (Mchoro 4C). Matibabu ya IPA pekee ndiyo yaliyopunguza ujazo wa wastani wa mitochondria na kubadilisha uwiano wa mitochondria kutoka mofolojia ya duara hadi ya kati ikilinganishwa na kundi la udhibiti (Mchoro 4A). Kwa upande mwingine, umbo la duara, urefu wa wastani wa tawi, na shughuli za mitochondria zilizopimwa na MTR inayotegemea utando wa mitochondria (Mchoro 4A na E) zilibaki bila kubadilika na vigezo hivi havikutofautiana kati ya vikundi. Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kwamba matibabu ya TGF-β1 na IPA yanaonekana kurekebisha umbo na ukubwa wa mitochondria pamoja na ugumu wa mtandao katika seli hai za LX-2.
IPA hubadilisha mienendo ya mitochondria na wingi wa DNA ya mitochondria katika seli za LX-2. A. Picha wakilishi za siri za seli hai za LX-2 zilizowekwa ndani ya TGF-β1 (5 ng/ml) na 1 mM IPA kwa saa 24 katika hali isiyo na seramu inayoonyesha mitandao ya mitochondria iliyotiwa rangi ya Mitotracker™ Red CMXRos na viini vilivyotiwa rangi ya bluu na DAPI. Data zote zilikuwa na angalau picha 15 kwa kila kundi. Tulipata picha 10 za Z-stack kwa kila aina ya sampuli. Kila mfuatano wa mhimili wa Z ulikuwa na vipande 30, kila kimoja kikiwa na unene wa 9.86 μm. Upau wa kipimo: 10 μm. B. Vitu wakilishi (mitochondria pekee) vilivyotambuliwa kwa kutumia kizingiti kinachoweza kubadilika kwenye picha. Uchambuzi wa kiasi na ulinganisho wa miunganisho ya mtandao wa mofolojia ya mitochondria ulifanywa kwa seli zote katika kila kundi. C. Mara kwa mara ya uwiano wa umbo la mitochondria. Thamani zilizo karibu na 0 zinaonyesha maumbo ya duara, na thamani zilizo karibu na 1 zinaonyesha maumbo ya nyuzi. D Kiwango cha DNA ya Mitochondria (mtDNA) kilibainishwa kama ilivyoelezwa katika Nyenzo na Mbinu. Uchambuzi wa E Mitotracker™ Red CMXRos ulifanywa kwa kutumia saitometri ya mtiririko (matukio 30,000) kama ilivyoelezwa katika Nyenzo na Mbinu. Data imewasilishwa kama wastani ± SD, n = majaribio 3 huru. Ulinganisho wa takwimu ulifanywa kwa kutumia jaribio la njia moja la ANOVA na Bonferroni baada ya hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Kisha tukachambua kiwango cha mtDNA katika seli za LX-2 kama kiashiria cha idadi ya mitochondria. Ikilinganishwa na kundi la udhibiti, kiwango cha mtDNA kiliongezeka katika kundi lililotibiwa na TGF-β1 (Mchoro 4D). Ikilinganishwa na kundi lililotibiwa na TGF-β1, kiwango cha mtDNA kilipunguzwa katika kundi la matibabu mchanganyiko (Mchoro 4D), ikidokeza kwamba IPA inaweza kupunguza kiwango cha mtDNA na pengine idadi ya mitochondria pamoja na upumuaji wa mitochondria (Mchoro 3C). Zaidi ya hayo, IPA ilionekana kupunguza kiwango cha mtDNA katika matibabu mchanganyiko lakini haikuathiri shughuli ya mitochondria inayosababishwa na MTR (Mchoro 4A–C).
Tulichunguza uhusiano wa IPA na viwango vya mRNA vya jeni zinazohusiana na fibrosis, apoptosis, kuishi, na mienendo ya mitochondrial katika seli za LX-2 (Mchoro 5A–D). Ikilinganishwa na kundi la udhibiti, kundi lililotibiwa na TGF-β1 lilionyesha ongezeko la usemi wa jeni kama vile mnyororo wa α2 aina ya kolajeni I (COL1A2), actin ya misuli laini ya α-α (αSMA), metalloproteinase ya matrix 2 (MMP2), kizuizi cha tishu cha metalloproteinase 1 (TIMP1), na jeni linalofanana na dynamin 1 (DRP1), ikionyesha ongezeko la fibrosis na uanzishaji. Zaidi ya hayo, ikilinganishwa na kundi la udhibiti, matibabu ya TGF-β1 yalipunguza viwango vya mRNA vya kipokezi cha nuclear pregnane X (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, kizuizi cha α-seli ya B, kiboreshaji cha peptidi ya mwanga wa jeni ya nuclear factor κ (NFκB1A), na kizuizi cha subunit ya nuclear factor κB kinase β (IKBKB) (Mchoro 5A–D). Ikilinganishwa na matibabu ya TGF-β1, matibabu mchanganyiko yenye TGF-β1 na IPA yalipunguza usemi wa COL1A2 na MMP2, lakini yaliongeza viwango vya mRNA vya PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, na IKBKB. Matibabu ya IPA yalipunguza kwa kiasi kikubwa usemi wa MMP2, protini inayohusishwa na Bcl-2 X (BAX), AKT1, protini ya atrophy ya macho 1 (OPA1), na protini ya mitochondrial fusion 2 (MFN2), ilhali usemi wa CASP8, NFκB1A, NFκB1B, na IKBKB uliongezeka ikilinganishwa na kundi la udhibiti. Hata hivyo, hakuna tofauti iliyopatikana katika usemi wa caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1), na fission protein 1 (FIS1). Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kwamba matibabu ya IPA hurekebisha usemi wa jeni zinazohusiana na fibrosis, apoptosis, kuishi, na mienendo ya mitochondrial. Data yetu inaonyesha kwamba matibabu ya IPA hupunguza fibrosis katika seli za LX-2; wakati huo huo, huchochea kuishi kwa kuhamisha fenotipu kuelekea kutofanya kazi.
IPA hurekebisha usemi wa jeni za mienendo ya fibroblast, apoptotiki, uhai, na mienendo ya mitochondria katika seli za LX-2. Histogramu huonyesha usemi wa mRNA ukilinganisha na udhibiti wa ndani (RPLP0 au PPIA) baada ya seli za LX-2 kuchochewa na TGF-β1 na IPA katika hali isiyo na seramu kwa saa 24. A inaonyesha fibroblasti, B inaonyesha seli za apoptotiki, C inaonyesha seli zilizosalia, na D inaonyesha usemi wa jeni wa mienendo ya mitochondria. Data zinawasilishwa kama wastani ± kupotoka kwa kawaida (SD), n = majaribio 3 huru. Ulinganisho wa takwimu ulifanywa kwa kutumia jaribio la njia moja la ANOVA na Bonferroni baada ya hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Kisha, mabadiliko katika ukubwa wa seli (FSC-H) na ugumu wa saitoplazimu (SSC-H) yalipimwa kwa kutumia saitoplazimu ya mtiririko (Mchoro 6A,B), na mabadiliko katika umbo la seli baada ya matibabu ya IPA yalipimwa kwa kutumia hadubini ya elektroni ya upitishaji (TEM) na hadubini ya utofautishaji wa awamu (Mchoro wa Nyongeza 6A-B). Kama ilivyotarajiwa, seli katika kundi lililotibiwa na TGF-β1 ziliongezeka kwa ukubwa ikilinganishwa na kundi la udhibiti (Mchoro 6A,B), zikionyesha upanuzi wa kawaida wa retikulamu mbaya ya endoplasmi (ER*) na fagolysosomes (P), ikionyesha uanzishaji wa seli shina ya hematopoietic (HSC) (Mchoro wa Nyongeza 6A). Hata hivyo, ikilinganishwa na kundi lililotibiwa na TGF-β1, ukubwa wa seli, ugumu wa saitoplazimu (Mchoro 6A,B), na kiwango cha ER* kilipungua katika kundi la matibabu mchanganyiko wa TGF-β1 na IPA (Mchoro wa Nyongeza 6A). Zaidi ya hayo, matibabu ya IPA yalipunguza ukubwa wa seli, ugumu wa saitoplazimu (Michoro 6A,B), kiwango cha P na ER* (Mchoro wa Nyongeza 6A) ikilinganishwa na kundi la udhibiti. Zaidi ya hayo, kiwango cha seli za apoptotiki kiliongezeka baada ya saa 24 za matibabu ya IPA ikilinganishwa na kundi la udhibiti (mishale nyeupe, Mchoro wa Nyongeza 6B). Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kwamba IPA 1 mM inaweza kuchochea apoptosis ya HSC na kubadilisha mabadiliko katika vigezo vya mofolojia ya seli vinavyosababishwa na TGF-β1, na hivyo kudhibiti ukubwa na ugumu wa seli, ambao unaweza kuhusishwa na kuzima kwa HSC.
IPA hubadilisha ukubwa wa seli na ugumu wa saitoplazimu katika seli za LX-2. Picha wakilishi za uchambuzi wa saitoplazimu ya mtiririko. Uchambuzi ulitumia mkakati maalum wa kuingilia seli za LX-2: SSC-A/FSC-A kufafanua idadi ya seli, FSC-H/FSC-A kutambua doublets, na SSC-H/FSC-H kwa ukubwa wa seli na uchanganuzi wa ugumu. Seli ziliwekwa ndani ya incubation na TGF-β1 (5 ng/ml) na 1 mM IPA katika hali isiyo na seramu kwa saa 24. Seli za LX-2 zilisambazwa katika roboduara ya chini kushoto (SSC-H-/FSC-H-), roboduara ya juu kushoto (SSC-H+/FSC-H-), roboduara ya chini kulia (SSC-H-/FSC-H+), na roboduara ya juu kulia (SSC-H+/FSC-H+) kwa ukubwa wa seli na uchanganuzi wa ugumu wa saitoplazimu. B. Mofolojia ya seli ilichambuliwa kwa kutumia saitometri ya mtiririko kwa kutumia FSC-H (mtawanyiko wa mbele, ukubwa wa seli) na SSC-H (mtawanyiko wa upande, ugumu wa saitoplazimu) (matukio 30,000). Data imewasilishwa kama wastani ± SD, n = majaribio 3 huru. Ulinganisho wa takwimu ulifanywa kwa kutumia jaribio la ANOVA la njia moja na jaribio la Bonferroni baada ya hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 na ****p < 0.0001
Metaboliti za utumbo kama vile IPA zimekuwa mada maarufu ya utafiti, ikidokeza kwamba malengo mapya yanaweza kugunduliwa katika microbiota ya utumbo. Kwa hivyo inavutia kwamba IPA, metaboliti ambayo tumeihusisha na fibrosis ya ini kwa wanadamu [15], imeonyeshwa kuwa kiwanja kinachoweza kupambana na nyuzinyuzi katika mifano ya wanyama [13, 14]. Hapa, tunaonyesha kwa mara ya kwanza uhusiano kati ya IPA ya seramu na transcriptomics ya ini ya kimataifa na methylation ya DNA kwa watu wanene wasio na kisukari cha aina ya 2 (T2D), ikiangazia apoptosis, mitofagia na maisha marefu, pamoja na jeni linalowezekana la AKT1 linalodhibiti homeostasis ya ini. Upya mwingine wa utafiti wetu ni kwamba tulionyesha mwingiliano wa matibabu ya IPA na apoptosis, mofolojia ya seli, bioenergetics ya mitochondrial na mienendo katika seli za LX-2, ikionyesha wigo mdogo wa nishati unaobadilisha phenotype ya HSC kuelekea kuzima, na kuifanya IPA kuwa mgombea anayewezekana wa kuboresha fibrosis ya ini.
Tuligundua kuwa apoptosis, mitofagia na maisha marefu zilikuwa njia muhimu zaidi za kisheria zilizoimarishwa katika jeni za ini zinazohusiana na IPA inayozunguka kwenye seramu. Usumbufu wa mfumo wa udhibiti wa ubora wa mitochondria (MQC) unaweza kusababisha kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria, mitofagia na apoptosis, na hivyo kukuza kutokea kwa MASLD[33, 34]. Kwa hivyo, tunaweza kukisia kwamba IPA inaweza kuhusika katika kudumisha mienendo ya seli na uadilifu wa mitochondria kupitia apoptosis, mitofagia na maisha marefu kwenye ini. Data yetu ilionyesha kuwa jeni mbili zilikuwa za kawaida katika majaribio hayo matatu: YKT6 na AKT1. Inafaa kuzingatia kwamba YKT6 ni protini ya SNARE inayohusika katika mchakato wa muunganiko wa utando wa seli. Ina jukumu katika autophagia na mitofagia kwa kuunda mchanganyiko wa uanzishaji na STX17 na SNAP29 kwenye autophagosome, na hivyo kukuza muunganiko wa autophagosome na lysosomes[35]. Zaidi ya hayo, kupotea kwa utendaji kazi wa YKT6 husababisha kuharibika kwa mitofaji [36], huku kuongezeka kwa YKT6 kuhusishwa na kuendelea kwa saratani ya ini (HCC), kuonyesha kuongezeka kwa uhai wa seli [37]. Kwa upande mwingine, AKT1 ndiyo jeni muhimu zaidi inayoingiliana na ina jukumu muhimu katika magonjwa ya ini, ikiwa ni pamoja na njia ya ishara ya PI3K/AKT, mzunguko wa seli, uhamiaji wa seli, kuongezeka, mshikamano wa fokasi, utendaji kazi wa mitochondrial, na utolewaji wa kolajeni [38–40]. Njia ya ishara ya PI3K/AKT iliyoamilishwa inaweza kuamsha seli shina za hematopoietic (HSCs), ambazo ni seli zinazohusika na uzalishaji wa matrix ya nje ya seli (ECM), na usumbufu wake unaweza kuchangia kutokea na kuendelea kwa fibrosis ya ini [40]. Kwa kuongezea, AKT ni mojawapo ya vipengele muhimu vya kuishi kwa seli vinavyozuia apoptosis ya seli inayotegemea p53, na uanzishaji wa AKT unaweza kuhusishwa na kizuizi cha apoptosis ya seli ya ini [41, 42]. Matokeo yaliyopatikana yanaonyesha kwamba IPA inaweza kuhusika katika apoptosis inayohusiana na mitochondria ya ini kwa kuathiri uamuzi wa hepatocytes kati ya kuingia apoptosis au kuishi. Athari hizi zinaweza kudhibitiwa na jeni zinazopendekezwa za AKT na/au YKT6, ambazo ni muhimu kwa homeostasis ya ini.
Matokeo yetu yalionyesha kuwa 1 mM IPA ilisababisha apoptosis na kupungua kwa upumuaji wa mitochondria katika seli za LX-2 bila kujali matibabu ya TGF-β1. Ni muhimu kuzingatia kwamba apoptosis ni njia kuu ya utatuzi wa fibrosis na uanzishaji wa seli shina za hematopoietiki (HSC), na pia ni tukio muhimu katika mwitikio wa kisaikolojia unaoweza kubadilishwa wa fibrosis ya ini [4, 43]. Zaidi ya hayo, urejesho wa BHI katika seli za LX-2 baada ya matibabu mchanganyiko ulitoa ufahamu mpya kuhusu jukumu linalowezekana la IPA katika udhibiti wa bioenergetics za mitochondria. Chini ya hali ya kupumzika na isiyofanya kazi, seli za hematopoietiki kwa kawaida hutumia fosforasi ya oksidi ya mitochondria kutoa ATP na kuwa na shughuli ndogo ya kimetaboliki. Kwa upande mwingine, uanzishaji wa HSC huongeza upumuaji wa mitochondria na usanisi wa kibiolojia ili kufidia mahitaji ya nishati ya kuingia katika hali ya glycolytic [44]. Ukweli kwamba IPA haikuathiri uwezo wa kimetaboliki na ECAR unaonyesha kwamba njia ya glycolytic haijapewa kipaumbele sana. Vile vile, utafiti mwingine ulionyesha kuwa 1 mM IPA iliweza kudhibiti shughuli za mnyororo wa upumuaji wa mitochondria katika cardiomyocytes, mstari wa seli za hepatocyte ya binadamu (Huh7) na seli za endothelial za mshipa wa kitovu cha binadamu (HUVEC); Hata hivyo, hakuna athari ya IPA iliyopatikana kwenye glikolisi katika cardiomyocytes, ikidokeza kwamba IPA inaweza kuathiri bioenergetics za aina zingine za seli [45]. Kwa hivyo, tunadhania kwamba 1 mM IPA inaweza kufanya kazi kama uncoupler ya kemikali kidogo, kwani inaweza kupunguza kwa kiasi kikubwa usemi wa jeni la fibrojeni, mofolojia ya seli na bioenergetics ya mitochondria bila kubadilisha kiasi cha mtDNA [46]. Viungio vya mitochondria vinaweza kuzuia fibrosis inayosababishwa na utamaduni na uanzishaji wa HSC [47] na kupunguza uzalishaji wa ATP ya mitochondria unaodhibitiwa au unaosababishwa na protini fulani kama vile protini za uncoupling (UCP) au adenine nukleotidi translocase (ANT). Kulingana na aina ya seli, jambo hili linaweza kulinda seli kutokana na apoptosis na/au kukuza apoptosis [46]. Hata hivyo, tafiti zaidi zinahitajika ili kufafanua jukumu la IPA kama kitenganishi cha mitochondrial katika kuzima kwa seli shina za damu.
Kisha tukachunguza kama mabadiliko katika upumuaji wa mitochondria yanaonekana katika mofolojia ya mitochondria katika seli hai za LX-2. Cha kufurahisha ni kwamba, matibabu ya TGF-β1 hubadilisha uwiano wa mitochondria kutoka duara hadi kati, huku matawi ya mitochondria yakipungua na ongezeko la usemi wa DRP1, jambo muhimu katika mgawanyiko wa mitochondria [48]. Zaidi ya hayo, kugawanyika kwa mitochondria kunahusishwa na ugumu wa jumla wa mtandao, na mpito kutoka kwa muunganiko hadi mgawanyiko ni muhimu kwa uanzishaji wa seli shina za hematopoietiki (HSC), ilhali kizuizi cha mgawanyiko wa mitochondria husababisha apoptosis ya HSC [49]. Kwa hivyo, matokeo yetu yanaonyesha kuwa matibabu ya TGF-β1 yanaweza kusababisha kupungua kwa ugumu wa mtandao wa mitochondria kwa kupungua kwa matawi, ambayo ni ya kawaida zaidi katika mgawanyiko wa mitochondria unaohusishwa na seli shina za hematopoietiki zilizoamilishwa (HSCs). Zaidi ya hayo, data yetu ilionyesha kuwa IPA inaweza kubadilisha uwiano wa mitochondria kutoka umbo la duara hadi la kati, na hivyo kupunguza usemi wa OPA1 na MFN2. Uchunguzi umeonyesha kuwa kupungua kwa OPA1 kunaweza kusababisha kupungua kwa uwezo wa utando wa mitochondria na kusababisha apoptosis ya seli [50]. MFN2 inajulikana kupatanisha muunganiko wa mitochondria na apoptosis[51]. Matokeo yaliyopatikana yanaonyesha kwamba uanzishaji wa seli za LX-2 na TGF-β1 na/au IPA unaonekana kurekebisha umbo na ukubwa wa mitochondria, pamoja na hali ya uanzishaji na ugumu wa mtandao.
Matokeo yetu yanaonyesha kuwa matibabu mchanganyiko ya TGFβ-1 na IPA yanaweza kupunguza vigezo vya mtDNA na mofolojia ya seli kwa kudhibiti usemi wa mRNA wa fibrosis, apoptosis na jeni zinazohusiana na kuishi katika seli zinazoepuka apoptosis. Hakika, IPA ilipunguza kiwango cha usemi wa mRNA wa jeni muhimu za fibrosis kama vile COL1A2 na MMP2, lakini iliongeza kiwango cha usemi wa CASP8, ambacho kinahusishwa na apoptosis. Matokeo yetu yalionyesha kuwa baada ya matibabu ya IPA, usemi wa BAX ulipungua na usemi wa mRNA wa vitengo vidogo vya familia ya TIMP1, BCL-2 na NF-κB uliongezeka, ikidokeza kwamba IPA inaweza kuchochea ishara za kuishi katika seli shina za hematopoietic (HSCs) zinazoepuka apoptosis. Molekuli hizi zinaweza kufanya kazi kama ishara za kuunga mkono kuishi katika seli shina za hematopoietic zilizoamilishwa, ambazo zinaweza kuhusishwa na usemi ulioongezeka wa protini za kupambana na apoptosis (kama vile Bcl-2), usemi uliopungua wa BAX ya kuunga mkono, na mwingiliano tata kati ya TIMP na NF-κB [5, 7]. IPA hutoa athari zake kupitia PXR, na tuligundua kuwa matibabu ya pamoja na TGF-β1 na IPA yaliongeza viwango vya usemi wa mRNA ya PXR, ikionyesha kukandamizwa kwa uanzishaji wa HSC. Ishara ya PXR iliyowashwa inajulikana kuzuia uanzishaji wa HSC katika mwili na katika vitro [52, 53]. Matokeo yetu yanaonyesha kuwa IPA inaweza kushiriki katika uondoaji wa HSC zilizowashwa kwa kukuza apoptosis, kupunguza fibrosis na kimetaboliki ya mitochondria, na kuongeza ishara za kuishi, ambazo ni michakato ya kawaida inayobadilisha phenotype ya HSC iliyowashwa kuwa ile isiyoamilishwa. Maelezo mengine yanayowezekana kwa utaratibu na jukumu la IPA katika apoptosis ni kwamba huondoa mitochondria isiyofanya kazi kimsingi kupitia mitofaji (njia ya ndani) na njia ya ishara ya TNF ya nje (Jedwali 1), ambayo imeunganishwa moja kwa moja na njia ya ishara ya kuishi ya NF-κB (Mchoro wa Nyongeza 7). Cha kufurahisha ni kwamba, jeni zilizoimarishwa zinazohusiana na IPA zinaweza kusababisha ishara za kuchochea ukuaji wa seli na kuchochea uhai katika njia ya kuchochea ukuaji wa seli [54], ikidokeza kwamba IPA inaweza kusababisha njia ya kuchochea ukuaji wa seli au uhai kwa kuingiliana na jeni hizi. Hata hivyo, jinsi IPA inavyosababisha ukuaji wa seli au uhai wakati wa uanzishaji wa HSC na njia zake za kiufundi bado hazijaeleweka.
IPA ni metaboliti ya vijidudu inayoundwa kutoka kwa tryptophan ya lishe kupitia microbiota ya utumbo. Uchunguzi umeonyesha kuwa ina sifa za udhibiti wa kuzuia uchochezi, antioxidant, na epigenetic katika mazingira ya utumbo.[55] Uchunguzi umeonyesha kuwa IPA inaweza kudhibiti utendaji kazi wa kizuizi cha utumbo na kupunguza msongo wa oksidi, ambao unaweza kuchangia athari zake za kisaikolojia za ndani.[56] Kwa kweli, IPA husafirishwa hadi kwenye viungo lengwa kupitia mzunguko wa damu, na kwa kuwa IPA inashiriki muundo mkuu sawa wa metaboliti na tryptophan, serotonin, na derivatives za indole, IPA hufanya vitendo vya kimetaboliki na kusababisha hatima za kimetaboliki za ushindani.[52] IPA inaweza kushindana na metaboliti zinazotokana na tryptophan kwa maeneo ya kufungamana kwenye vimeng'enya au vipokezi, na hivyo kuvuruga njia za kawaida za kimetaboliki. Hii inaangazia hitaji la tafiti zaidi kuhusu pharmacokinetics yake na pharmacodynamics ili kuelewa vyema dirisha lake la matibabu.[57] Bado haijabainika ikiwa hii inaweza pia kutokea katika seli shina za hematopoietic (HSCs).
Tunakubali kwamba utafiti wetu una mapungufu kadhaa. Ili kuchunguza haswa uhusiano unaohusiana na IPA, tuliwatenga wagonjwa walio na kisukari cha aina ya 2 (T2DM). Tunakubali kwamba hii inapunguza matumizi mapana ya matokeo yetu kwa wagonjwa walio na kisukari cha aina ya 2 na ugonjwa wa ini ulioendelea. Ingawa mkusanyiko wa kisaikolojia wa IPA katika seramu ya binadamu ni 1–10 μM [11, 20], mkusanyiko wa 1 mM IPA ulichaguliwa kulingana na mkusanyiko wa juu zaidi usio na sumu [15] na kiwango cha juu zaidi cha apoptosis, bila tofauti katika asilimia ya idadi ya seli zilizokufa. Ingawa viwango vya juu vya IPA vilitumika katika utafiti huu, kwa sasa hakuna makubaliano kuhusu kipimo kinachofaa cha IPA [52]. Ingawa matokeo yetu ni muhimu, hatima pana ya kimetaboliki ya IPA inabaki kuwa eneo linalofanya kazi la utafiti. Zaidi ya hayo, matokeo yetu kuhusu uhusiano kati ya viwango vya IPA katika seramu na methylation ya DNA ya nakala za ini hayakupatikana tu kutoka kwa seli shina za hematopoietic (HSCs) bali pia kutoka kwa tishu za ini. Tulichagua kutumia seli za LX-2 za binadamu kulingana na matokeo yetu ya awali kutoka kwa uchambuzi wa transcriptome kwamba IPA inahusishwa na uanzishaji wa seli shina za hematopoietic (HSC) [15], na HSC ndizo seli kuu zinazohusika katika ukuaji wa fibrosis ya ini. Ini linaundwa na aina nyingi za seli, kwa hivyo mifumo mingine ya seli kama vile mfumo wa uundaji wa seli za kinga ya hepatocyte-HSC pamoja na uanzishaji wa caspase na mgawanyiko wa DNA pamoja na utaratibu wa utendaji ikiwa ni pamoja na kiwango cha protini inapaswa kuzingatiwa ili kusoma jukumu la IPA na mwingiliano wake na aina zingine za seli za ini.