Nadharia tofauti za ulinzi wa mimea hutoa mwongozo muhimu wa kinadharia kwa kuelezea mifumo ya kimetaboliki maalum ya mimea, lakini utabiri wao muhimu bado haujajaribiwa. Hapa, tulitumia uchanganuzi wa spektrometri ya wingi wa sanjari (MS/MS) usio na upendeleo ili kuchunguza kimetaboliki ya aina zilizopunguzwa za tumbaku kutoka kwa mimea moja hadi ya watu na spishi zinazohusiana kwa karibu, na kusindika idadi kubwa ya nadharia za vipengele vya spektrometri ya wingi kulingana na spektrometri kiwanja katika taarifa. Mfumo wa kujaribu utabiri muhimu wa nadharia bora za ulinzi (OD) na zinazosonga za shabaha (MT). Sehemu ya taarifa ya metabolomiki ya mimea inaendana na nadharia ya OD, lakini inapingana na utabiri mkuu wa nadharia ya MT kuhusu mienendo ya metabolomiki inayosababishwa na wanyama walao majani. Kuanzia kiwango kidogo hadi cha mageuko ya jumla, ishara ya jasmonate ilitambuliwa kama kiashiria kikuu cha OD, huku ishara ya ethilini ikitoa urekebishaji mzuri wa mwitikio maalum wa mimea walao majani uliofafanuliwa na mtandao wa molekuli wa MS/MS.
Metaboliti maalum zenye miundo mbalimbali ndizo washiriki wakuu katika urekebishaji wa mimea kwa mazingira, hasa katika ulinzi wa maadui (1). Utofauti wa ajabu wa kimetaboliki maalum inayopatikana katika mimea umechochea miongo kadhaa ya utafiti wa kina kuhusu vipengele vyake vingi vya kazi za ikolojia, na umeunda orodha ndefu ya nadharia za ulinzi wa mimea, ambazo ni maendeleo ya mageuko na ikolojia ya mwingiliano wa mimea na wadudu. Utafiti wa majaribio hutoa mwongozo muhimu (2). Hata hivyo, nadharia hizi za ulinzi wa mimea hazikufuata njia ya kawaida ya hoja ya nadharia, ambapo utabiri muhimu ulikuwa katika kiwango sawa cha uchambuzi (3) na ulijaribiwa kwa majaribio ili kuendeleza mzunguko unaofuata wa maendeleo ya kinadharia (4). Vikwazo vya kiufundi vinazuia ukusanyaji wa data kwa kategoria maalum za kimetaboliki na huondoa uchambuzi kamili wa metaboliti maalum, hivyo kuzuia ulinganisho kati ya kategoria ambazo ni muhimu kwa maendeleo ya kinadharia (5). Ukosefu wa data kamili ya kimetaboliki na sarafu ya pamoja ya kulinganisha mtiririko wa kazi wa usindikaji wa nafasi ya kimetaboliki kati ya vikundi tofauti vya mimea huzuia ukomavu wa kisayansi wa uwanja huo.
Maendeleo ya hivi karibuni katika uwanja wa metabolomiki za sanjari (MS/MS) yanaweza kuainisha kikamilifu mabadiliko ya kimetaboliki ndani na kati ya spishi za mfumo fulani, na yanaweza kuunganishwa na mbinu za kompyuta ili kuhesabu kufanana kwa kimuundo kati ya michanganyiko hii tata. Ujuzi wa awali wa kemia (5). Mchanganyiko wa teknolojia za hali ya juu katika uchambuzi na kompyuta hutoa mfumo muhimu wa majaribio ya muda mrefu ya utabiri mwingi uliofanywa na nadharia za kiikolojia na mageuko ya utofauti wa kimetaboliki. Shannon (6) alianzisha nadharia ya habari kwa mara ya kwanza katika makala yake muhimu mnamo 1948, akiweka msingi wa uchambuzi wa hisabati wa habari, ambao umetumika katika nyanja nyingi isipokuwa matumizi yake ya awali. Katika jenomu, nadharia ya habari imetumika kwa mafanikio kupima taarifa za kihafidhina za mlolongo (7). Katika utafiti wa transcriptomics, nadharia ya habari inachambua mabadiliko ya jumla katika transcriptomics (8). Katika utafiti uliopita, tulitumia mfumo wa takwimu wa nadharia ya habari kwa metabolomiki kuelezea utaalamu wa kimetaboliki wa kiwango cha tishu katika mimea (9). Hapa, tunachanganya mtiririko wa kazi unaotegemea MS/MS na mfumo wa takwimu wa nadharia ya habari, unaojulikana na utofauti wa kimetaboliki katika sarafu ya kawaida, ili kulinganisha utabiri muhimu wa nadharia ya ulinzi wa mimea ya metabolomu inayosababishwa na wanyama walao majani.
Mifumo ya kinadharia ya ulinzi wa mimea kwa kawaida huwa jumuishi na inaweza kugawanywa katika makundi mawili: yale yanayojaribu kuelezea usambazaji wa metaboliti maalum za mimea kulingana na kazi za ulinzi, kama vile ulinzi bora (OD) (10), lengo linalosonga (MT) (11)) Na nadharia ya mwonekano (12), huku mengine yakitafuta maelezo ya kiufundi kuhusu jinsi mabadiliko katika upatikanaji wa rasilimali yanavyoathiri ukuaji wa mimea na mkusanyiko wa metaboliti maalum, kama vile kaboni: dhana ya usawa wa virutubisho (13), dhana ya kiwango cha ukuaji (14), na dhana ya usawa wa ukuaji na utofautishaji (15). Seti mbili za nadharia ziko katika viwango tofauti vya uchambuzi (4). Hata hivyo, nadharia mbili zinazohusisha kazi za ulinzi katika kiwango cha utendaji hutawala mazungumzo kuhusu ulinzi wa mimea unaojumuisha na unaoweza kusababishwa: nadharia ya OD, ambayo inadhani kwamba mimea huwekeza katika ulinzi wao wa kemikali wa gharama kubwa tu inapohitajika, kwa mfano, inapomezwa Wakati mnyama wa nyasi anaposhambulia, kwa hivyo, kulingana na uwezekano wa shambulio la baadaye, kiwanja chenye kazi ya ulinzi hupewa (10); Dhana ya MT inapendekeza kwamba hakuna mhimili wa mabadiliko ya metaboliti ya mwelekeo, lakini metaboliti hubadilika bila mpangilio, hivyo kuunda uwezekano Kuzuia "lengo la mwendo" wa kimetaboliki wa wanyama walao majani wanaoshambulia. Kwa maneno mengine, nadharia hizi mbili hutoa utabiri tofauti kuhusu urekebishaji wa kimetaboliki unaotokea baada ya shambulio la wanyama walao majani: uhusiano kati ya mkusanyiko wa metaboliti wa mwelekeo mmoja na kazi ya kujilinda (OD) na mabadiliko ya kimetaboliki yasiyoelekezwa (MT) (11).
Nadharia za OD na MT hazihusishi tu mabadiliko yanayosababishwa katika metabolomu, lakini pia matokeo ya kiikolojia na mageuko ya mkusanyiko wa metaboli hizi, kama vile gharama za kukabiliana na faida za mabadiliko haya ya kimetaboliki katika mazingira maalum ya kiikolojia (16). Ingawa nadharia zote mbili zinatambua kazi ya kujilinda ya metaboli maalum, ambayo inaweza kuwa ghali au isiwe ghali, utabiri muhimu unaotofautisha nadharia za OD na MT upo katika mwelekeo wa mabadiliko ya kimetaboliki yanayosababishwa. Utabiri wa nadharia ya OD umepokea umakini mkubwa wa majaribio hadi sasa. Vipimo hivi vinajumuisha utafiti wa kazi za ulinzi wa moja kwa moja au zisizo za moja kwa moja za tishu tofauti za misombo maalum katika nyumba za kijani na hali ya asili, pamoja na mabadiliko katika hatua ya ukuaji wa mimea (17-19). Hata hivyo, hadi sasa, kutokana na ukosefu wa mtiririko wa kazi na mfumo wa takwimu kwa ajili ya uchambuzi kamili wa kimataifa wa utofauti wa kimetaboliki wa kiumbe chochote, utabiri mkuu wa tofauti kati ya nadharia hizo mbili (yaani, mwelekeo wa mabadiliko ya kimetaboliki) unabaki kupimwa. Hapa, tunatoa uchambuzi kama huo.
Mojawapo ya sifa muhimu zaidi za metaboliti mahususi ya mimea ni utofauti wao mkubwa wa kimuundo katika ngazi zote kuanzia mimea moja, idadi ya watu hadi spishi zinazofanana (20). Mabadiliko mengi ya kiasi katika metaboliti maalum yanaweza kuzingatiwa katika kiwango cha idadi ya watu, huku tofauti kubwa za ubora kwa kawaida zikidumishwa katika kiwango cha spishi (20). Kwa hivyo, utofauti wa kimetaboliki ya mimea ndio kipengele kikuu cha utofauti wa utendaji kazi, kinachoonyesha uwezo wa kubadilika kwa niches tofauti, haswa niches hizo zenye uwezekano tofauti wa uvamizi na wadudu maalum na wanyama wa kawaida wanaokula mimea (21). Tangu makala ya Fraenkel (22) kuhusu sababu za kuwepo kwa metaboliti mahususi ya mimea, mwingiliano na wadudu mbalimbali umechukuliwa kama shinikizo muhimu la uteuzi, na mwingiliano huu unaaminika kuwa uliunda mimea wakati wa mageuko. Njia ya kimetaboliki (23). Tofauti kati ya spishi katika utofauti wa metaboliti maalum zinaweza pia kuonyesha usawa wa kisaikolojia unaohusishwa na ulinzi wa mimea unaojumuisha na unaoweza kusababishwa dhidi ya mikakati ya mimea inayokula mimea, kwani spishi hizo mbili mara nyingi huhusiana vibaya na kila mmoja (24). Ingawa inaweza kuwa na manufaa kudumisha ulinzi mzuri wakati wote, mabadiliko ya kimetaboliki kwa wakati unaofaa yanayohusiana na ulinzi hutoa faida dhahiri katika kuruhusu mimea kutenga rasilimali muhimu kwa uwekezaji mwingine wa kisaikolojia (19, 24), na kuepuka hitaji la ushirikiano. Uharibifu wa dhamana (25). Kwa kuongezea, upangaji huu mpya wa metaboli maalum zinazosababishwa na wadudu walao majani unaweza kusababisha usambazaji mbaya kwa idadi ya watu (26), na unaweza kuonyesha usomaji wa moja kwa moja wa mabadiliko makubwa ya asili katika ishara ya asidi ya jasmoniki (JA), ambayo inaweza kudumishwa kwa idadi ya watu. Ishara za juu na za chini za JA ni biashara kati ya ulinzi dhidi ya wanyama walao majani na ushindani na spishi maalum (27). Kwa kuongezea, njia maalum za kibiolojia za kimetaboliki zitapitia hasara na mabadiliko ya haraka wakati wa mageuko, na kusababisha usambazaji wa kimetaboliki usio na mpangilio miongoni mwa spishi zinazohusiana kwa karibu (28). Polimofimu hizi zinaweza kuanzishwa haraka ili kukabiliana na mabadiliko ya mifumo ya wanyama walao majani (29), ambayo ina maana kwamba kushuka kwa thamani kwa jamii za wanyama walao majani ni jambo muhimu linaloendesha tofauti za kimetaboliki.
Hapa, tumetatua matatizo yafuatayo mahususi. (I) Mdudu anayekula mimea anawezaje kurekebisha muundo wa metabolome ya mmea? (Ii) Ni vipengele gani vikuu vya taarifa vya unyumbufu wa kimetaboliki ambavyo vinaweza kupimwa ili kujaribu utabiri wa nadharia ya ulinzi wa muda mrefu? (Iii) Kama tupange upya metabolome ya mmea kwa njia ya kipekee kwa mshambuliaji, ikiwa ni hivyo, homoni ya mmea inachukua jukumu gani katika kurekebisha mwitikio maalum wa kimetaboliki, na ni metabolometi gani zinazochangia upekee wa spishi za ulinzi? (Iv) Kwa kuwa utabiri uliofanywa na nadharia nyingi za ulinzi unaweza kupanuliwa katika viwango vyote vya tishu za kibiolojia, tuliuliza jinsi mwitikio wa kimetaboliki unaosababishwa ulivyo thabiti kuanzia ulinganisho wa ndani hadi ulinganisho wa spishi? Kwa lengo hili, tumesoma kwa utaratibu metabolome ya majani ya nikotini ya tumbaku, ambayo ni mmea wa kielelezo cha ikolojia wenye kimetaboliki maalum, na unafaa dhidi ya mabuu ya wanyama wawili wa asili wanaokula mimea, Lepidoptera Datura (Bis) (Ms.) (Mkali sana, huliwa zaidi) Kwenye Solanaceae na Spodoptera littoralis (Sl), minyoo ya majani ya pamba ni aina ya "jenasi", pamoja na mimea mwenyeji wa Solanaceae na wenyeji wengine wa genera na familia zingine Chakula cha mimea. Tulichambua wigo wa metabolomiki wa MS/MS na kutoa maelezo ya takwimu ya nadharia ya habari ili kulinganisha nadharia za OD na MT. Unda ramani maalum ili kufichua utambulisho wa metaboliti muhimu. Uchambuzi huo uliongezwa kwa idadi ya asili ya N. nasi na spishi za tumbaku zinazohusiana kwa karibu ili kuchambua zaidi utofauti kati ya ishara ya homoni za mimea na uanzishaji wa OD.
Ili kunasa ramani ya jumla kuhusu unyumbufu na muundo wa metaboloma ya majani ya tumbaku inayokula mimea, tulitumia uchambuzi na mtiririko wa kazi wa hesabu uliotengenezwa hapo awali ili kukusanya kikamilifu na kuondoa spektri ya MS/MS isiyo na msongamano wa data yenye ubora wa juu kutoka kwa dondoo za mimea (9). Mbinu hii isiyotofautishwa (inayoitwa MS/MS) inaweza kujenga spektri ya misombo isiyo na msongamano, ambayo inaweza kutumika kwa uchanganuzi wote wa kiwango cha misombo ulioelezewa hapa. Metaboliti hizi za mimea zilizoondolewa msongamano ni za aina mbalimbali, zikiwa na mamia hadi maelfu ya metaboliti (karibu 500-1000-s/MS/MS hapa). Hapa, tunazingatia unyumbufu wa kimetaboliki katika mfumo wa nadharia ya habari, na kupima utofauti na taaluma ya metaboloma kulingana na entropi ya Shannon ya usambazaji wa masafa ya kimetaboliki. Kwa kutumia fomula iliyotekelezwa hapo awali (8), tulihesabu seti ya viashiria ambavyo vinaweza kutumika kupima utofauti wa metaboloma (kiashiria cha Hj), utaalamu wa wasifu wa kimetaboliki (kiashiria cha δj) na umaalumu wa kimetaboliki wa metaboliti moja (kiashiria cha Si). Zaidi ya hayo, tulitumia Kielelezo cha Umbali wa Umbali wa Uhusiano (RDPI) kupima uwezo wa metabolome kuchochea mimea ya walao majani (Mchoro 1A) (30). Ndani ya mfumo huu wa takwimu, tunachukulia wigo wa MS/MS kama kitengo cha taarifa cha msingi, na kusindika wingi wa MS/MS katika ramani ya usambazaji wa masafa, na kisha kutumia Shannon entropy kukadiria utofauti wa metabolome kutoka humo. Utaalamu wa metabolome hupimwa kwa upekee wa wastani wa wigo mmoja wa MS/MS. Kwa hivyo, ongezeko la wingi wa baadhi ya madarasa ya MS/MS baada ya uanzishaji wa mimea ya majani hubadilishwa kuwa uwezo wa spectral kuchochea mimea, RDPI na utaalamu, yaani, ongezeko la kielelezo cha δj, kwa sababu metaboliti maalum zaidi huzalishwa na kielelezo cha juu cha Si huzalishwa. Kupungua kwa kielelezo cha utofauti cha Hj kunaonyesha kwamba idadi ya MS/MS inayozalishwa imepunguzwa, au usambazaji wa masafa ya wasifu hubadilika katika mwelekeo usio sawa, huku ukipunguza kutokuwa na uhakika kwa jumla. Kupitia hesabu ya faharasa ya Si, inawezekana kuangazia ni MS/MS gani inayosababishwa na wanyama fulani walao majani, kinyume chake, ni MS/MS gani haijibu kwa utangulizi, ambayo ni kiashiria muhimu cha kutofautisha utabiri wa MT na OD.
(A) Vielezi vya takwimu vinavyotumika kwa wanyama wanaokula mimea (H1 hadi Hx) utofauti (RDPI), utofauti (kielezo cha Hj), utaalamu (kielezo cha δj) na umaalum wa metaboli (kielezo cha Si). Kuongezeka kwa kiwango cha utaalamu (δj) kunaonyesha kwamba, kwa wastani, metaboli zaidi maalum za wanyama wanaokula mimea zitazalishwa, huku kupungua kwa utofauti (Hj) kunaonyesha kupungua kwa uzalishaji wa metaboli au usambazaji usio sawa wa metaboli katika ramani ya usambazaji. Thamani ya Si hutathmini kama metaboli ni maalum kwa hali fulani (hapa, wanyama wanaokula mimea) au kinyume chake imedumishwa katika kiwango sawa. (B) Mchoro wa dhana wa utabiri wa nadharia ya ulinzi kwa kutumia mhimili wa nadharia ya habari. Nadharia ya OD inatabiri kwamba shambulio la wanyama wanaokula mimea litaongeza metaboli za ulinzi, na hivyo kuongeza δj. Wakati huo huo, Hj hupungua kwa sababu wasifu umepangwa upya kuelekea kutokuwa na uhakika wa taarifa za kimetaboliki. Nadharia ya MT inatabiri kwamba shambulio la wanyama wanaokula mimea litasababisha mabadiliko yasiyo ya mwelekeo katika metabolome, na hivyo kuongeza Hj kama kiashiria cha kuongezeka kwa kutokuwa na uhakika wa taarifa za kimetaboliki na kusababisha usambazaji nasibu wa Si. Pia tulipendekeza modeli mchanganyiko, MT bora zaidi, ambapo baadhi ya metaboliti zenye thamani kubwa za ulinzi zitaongezeka hasa (thamani ya juu ya Si), huku zingine zikionyesha majibu ya nasibu (thamani ya chini ya Si).
Kwa kutumia maelezo ya nadharia ya habari, tunatafsiri nadharia ya OD ili kutabiri kwamba mabadiliko maalum ya kimetaboliti yanayosababishwa na walaji mimea katika hali isiyosababishwa yatasababisha (i) ongezeko la umaalumu wa kimetaboliti (kielezo cha Si) kinachoendesha umaalumu wa kimetaboliti (kielezo cha δj) Ongezeko la) vikundi fulani maalum vya kimetaboliti vyenye thamani kubwa ya ulinzi, na (ii) kupungua kwa utofauti wa kimetaboliti (kielezo cha Hj) kutokana na mabadiliko ya usambazaji wa masafa ya kimetaboliti hadi usambazaji zaidi wa mwili wa leptini. Katika kiwango cha kimetaboliti moja, usambazaji wa Si uliopangwa unatarajiwa, ambapo kimetaboliti itaongeza thamani ya Si kulingana na thamani yake ya ulinzi (Mchoro 1B). Katika mstari huu, tunaelezea nadharia ya MT ili kutabiri kwamba msisimko utasababisha (i) mabadiliko yasiyo ya mwelekeo katika metaboliti yanayosababisha kupungua kwa kielezo cha δj, na (ii) ongezeko la kielezo cha Hj kutokana na ongezeko la kutokuwa na uhakika wa kimetaboliti. Au nasibu, ambayo inaweza kupimwa na Shannon entropy katika mfumo wa utofauti wa jumla. Kuhusu muundo wa kimetaboliti, nadharia ya MT itatabiri usambazaji nasibu wa Si. Kwa kuzingatia kwamba metaboliti fulani ziko chini ya hali maalum chini ya hali maalum, na hali zingine haziko chini ya hali maalum, na thamani yao ya ulinzi inategemea mazingira, pia tulipendekeza mfumo mchanganyiko wa ulinzi, ambapo δj na Hj husambazwa katika sehemu mbili kando ya Si. Ongeza katika pande zote, ni vikundi fulani vya metaboliti pekee, ambavyo vina thamani kubwa za ulinzi, ndivyo vitakavyoongeza hasa Si, huku vingine vikiwa na usambazaji nasibu (Mchoro 1B).
Ili kujaribu utabiri wa nadharia ya ulinzi uliofafanuliwa upya kwenye mhimili wa maelezo ya nadharia ya habari, tuliibua mabuu ya walao majani ya kitaalamu (Bi) au ya jumla (Sl) kwenye majani ya Nepenthes pallens (Mchoro 2A). Kwa kutumia uchambuzi wa MS/MS, tulipata spektra 599 zisizo na urejeshaji wa MS/MS (faili ya data S1) kutoka kwa dondoo za methanoli za tishu za majani zilizokusanywa baada ya kulisha viwavi. Kwa kutumia fahirisi za RDPI, Hj, na δj ili kuibua usanidi upya wa maudhui ya habari katika faili za usanidi wa MS/MS huonyesha mifumo ya kuvutia (Mchoro 2B). Mwelekeo wa jumla ni kwamba, kama ilivyoelezwa na maelezo ya habari, kadri viwavi wanavyoendelea kula majani, kiwango cha upangaji upya wa kimetaboliki huongezeka baada ya muda: saa 72 baada ya kula viwavi, RDPI huongezeka sana. Ikilinganishwa na udhibiti usioharibika, Hj ilipunguzwa sana, ambayo ilitokana na kiwango kilichoongezeka cha utaalamu wa wasifu wa kimetaboliki, ambacho kilipimwa na fahirisi ya δj. Mwelekeo huu dhahiri unaendana na utabiri wa nadharia ya OD, lakini hauendani na utabiri mkuu wa nadharia ya MT, ambayo inaamini kwamba mabadiliko ya nasibu (yasiyo ya mwelekeo) katika viwango vya metaboli hutumika kama kinga ya kujilinda (Mchoro 1B). Ingawa kiwango cha usiri wa mdomo (OS) na tabia ya kulisha ya wanyama hawa wawili walao majani ni tofauti, kulisha kwao moja kwa moja kulisababisha mabadiliko sawa katika mwelekeo wa Hj na δj wakati wa vipindi vya mavuno vya saa 24 na saa 72. Tofauti pekee ilitokea katika saa 72 za RDPI. Ikilinganishwa na ile iliyosababishwa na kulisha kwa Ms, kimetaboliki ya jumla iliyosababishwa na kulisha kwa Sl ilikuwa ya juu zaidi.
(A) Ubunifu wa majaribio: nguruwe wa kawaida (S1) au wanyama wanaokula mimea (Bi) hulishwa majani ya mimea ya mitungi yaliyoondolewa chumvi, huku kwa mimea ya mimea iliyoigwa, mfumo wa uendeshaji wa Ms (W + OSM) hutumika kushughulikia kutobolewa kwa nafasi za jani sanifu. Mabuu au maji ya S1 (W + OSSl). Kidhibiti (C) ni jani lisiloharibika. (B) Upungufu (RDPI ikilinganishwa na chati ya udhibiti), utofauti (kiashiria cha Hj) na kiashiria cha utaalamu (δj index) kilichohesabiwa kwa ramani maalum ya metabolite (599 MS/MS; faili ya data S1). Nyota zinaonyesha tofauti kubwa kati ya kulisha moja kwa moja kwa wanyama wanaokula mimea na kundi la udhibiti (jaribio la t la mwanafunzi lenye jaribio la t lililounganishwa, *P<0.05 na ***P<0.001). ns, si muhimu. (C) Kielezo cha azimio la muda cha kuu (sanduku la bluu, asidi amino, asidi kikaboni na sukari; faili ya data S2) na wigo maalum wa kimetaboliki (sanduku jekundu 443 MS/MS; faili ya data S1) baada ya matibabu ya mimea yaliyoigwa. Ukanda wa rangi unarejelea kipindi cha kujiamini cha 95%. Kinyota kinaonyesha tofauti kubwa kati ya matibabu na udhibiti [uchambuzi wa quadratic wa variance (ANOVA), ikifuatiwa na tofauti kubwa ya Tukey (HSD) kwa ulinganisho mwingi wa baada ya hoc, *P<0.05, **P<0.01 Na *** P <0.001]. (D) Utaalamu wa viwanja vya kutawanya na wasifu maalum wa kimetaboliki (sampuli zinazorudiwa na matibabu tofauti).
Ili kuchunguza kama urekebishaji unaosababishwa na mimea inayokula mimea katika kiwango cha metabolomu unaakisiwa katika mabadiliko katika kiwango cha metaboliti za kibinafsi, kwanza tulizingatia metaboliti zilizosomwa hapo awali kwenye majani ya Nepenthes pallens zenye upinzani uliothibitishwa wa mimea inayokula mimea. Amidi za phenolic ni viunganishi vya hidroksinamidi-polyamine ambavyo hujikusanya wakati wa mchakato wa mimea ya wadudu na vinajulikana kupunguza utendaji wa wadudu (32). Tulitafuta vitangulizi vya MS/MS husika na kuchora mikunjo yao ya kinetiki inayokusanywa (Mchoro S1). Haishangazi, vitokanavyo na fenoli ambavyo havihusiki moja kwa moja katika ulinzi dhidi ya mimea inayokula mimea, kama vile asidi ya klorogenic (CGA) na rutin, hupunguzwa udhibiti baada ya mimea inayokula mimea. Kwa upande mwingine, mimea inayokula mimea inaweza kufanya fenoli amidi kuwa na nguvu sana. Kulisha kwa wanyama hao wawili wanaokula mimea kulisababisha karibu wigo sawa wa uchochezi wa fenolidi, na muundo huu ulikuwa dhahiri hasa kwa usanisi mpya wa fenolidi. Jambo hilo hilo litaonekana wakati wa kuchunguza njia ya 17-hydroxygeranyl nonanediol diterpene glycosides (17-HGL-DTGs), ambayo hutoa idadi kubwa ya diterpenes zisizo na mzunguko zenye kazi bora za kupambana na walaji mimea (33), ambazo Bi. Kulisha na Sl kulisababisha wasifu sawa wa usemi (Mchoro S1)).
Ubaya unaowezekana wa majaribio ya kulisha wanyama walao majani moja kwa moja ni tofauti katika kiwango cha matumizi ya majani na muda wa kulisha wanyama walao majani, ambayo inafanya iwe vigumu kuondoa athari maalum za wanyama walao majani zinazosababishwa na majeraha na wanyama walao majani. Ili kutatua vyema upekee wa spishi za wanyama walao majani wa mwitikio wa kimetaboliki ya majani unaosababishwa, tuliiga kulisha mabuu ya Ms na Sl kwa kutumia mara moja OS iliyokusanywa hivi karibuni (OSM na OSS1) kwenye kiwango cha kawaida cha kutoboa W cha nafasi thabiti za majani. Utaratibu huu unaitwa matibabu ya W + OS, na huweka sanifu uanzishaji kwa kuweka muda sahihi wa mwanzo wa mwitikio unaosababishwa na wanyama walao majani bila kusababisha athari za kutatanisha za tofauti katika kiwango au wingi wa upotevu wa tishu (Mchoro 2A) (34). Kwa kutumia bomba la uchambuzi na hesabu la MS/MS, tulipata spektra 443 za MS/MS (faili la data S1), ambazo ziliingiliana na spektra zilizokusanywa hapo awali kutoka kwa majaribio ya moja kwa moja ya kulisha. Uchambuzi wa nadharia ya taarifa ya seti hii ya data ya MS/MS ulionyesha kuwa upangaji upya wa metabolomu maalum za majani kwa kuiga wanyama walao majani ulionyesha vichocheo maalum vya OS (Mchoro 2C). Hasa, ikilinganishwa na matibabu ya OSS1, OSM ilisababisha uboreshaji wa utaalamu wa metabolomu kwa saa 4. Ni muhimu kuzingatia kwamba ikilinganishwa na seti ya data ya majaribio ya kulisha wanyama walao majani moja kwa moja, kinetiki za kimetaboliki zilizoonekana katika nafasi ya pande mbili kwa kutumia Hj na δj kama viwianishi na mwelekeo wa utaalamu wa metabolomu katika kukabiliana na matibabu ya wanyama walao majani yaliyoigwa baada ya muda. Ongeza uthabiti (Mchoro 2D). Wakati huo huo, tulipima kiwango cha amino asidi, asidi kikaboni na sukari (faili la data S2) ili kuchunguza kama ongezeko hili lililolengwa la utaalamu wa metabolomu linatokana na usanidi upya wa kimetaboliki ya kaboni kuu katika kukabiliana na wanyama walao majani walioigwa (Mchoro S2). Ili kuelezea vyema muundo huu, tulifuatilia zaidi kinetiki za mkusanyiko wa kimetaboliki wa njia zilizojadiliwa hapo awali za phenolamide na 17-HGL-DTG. Uingizaji wa mimea ya mimea maalum ya OS hubadilishwa kuwa muundo tofauti wa mpangilio ndani ya metaboli ya fenolamide (Mchoro S3). Amidi za phenolic zenye coumarin na kafeoyl husababishwa kwa upendeleo na OSS1, huku OSM zikisababisha uingizaji maalum wa viungo vya ferulyl. Kwa njia ya 17-HGL-DTG, uingizaji tofauti wa OS kupitia bidhaa za malonylation na dimalonylation uligunduliwa (Mchoro S3).
Kisha, tulisoma unyumbufu wa transcriptome unaosababishwa na OS kwa kutumia seti ya data ya microarray ya muda, ambayo inaiga matumizi ya OSM kutibu majani ya majani ya mmea wa rosette katika wanyama walao majani. Kinetiki za sampuli kimsingi huingiliana na kinetiki zinazotumika katika utafiti huu wa metabolomiki (35). Ikilinganishwa na usanidi mpya wa metabolome ambapo unyumbufu wa kimetaboliki huongezeka hasa baada ya muda, tunaona milipuko ya muda mfupi ya unukuzi katika majani yanayosababishwa na Ms, ambapo unyumbufu wa transcriptome (RDPI) na utaalamu (δj) ziko katika 1 Kulikuwa na ongezeko kubwa la saa, na utofauti (Hj) katika hatua hii ya wakati, usemi wa BMP1 ulipunguzwa sana, ikifuatiwa na kulegea kwa utaalamu wa transcriptome (Mchoro S4). Familia za jeni za kimetaboliki (kama vile P450, glycosyltransferase, na BAHD acyltransferase) zinashiriki katika mchakato wa kukusanya metaboli maalum kutoka kwa vitengo vya kimuundo vinavyotokana na metaboli ya msingi, kufuatia modeli ya mapema ya utaalamu wa hali ya juu iliyotajwa hapo juu. Kama utafiti wa kesi, njia ya phenylalanine ilichambuliwa. Uchambuzi ulithibitisha kwamba jeni kuu katika umetaboli wa phenolamide husababishwa sana na OS katika wanyama walao majani ikilinganishwa na mimea isiyovutia, na zimeunganishwa kwa karibu katika mifumo yao ya usemi. Kipengele cha unukuzi MYB8 na jeni za kimuundo PAL1, PAL2, C4H na 4CL katika sehemu ya juu ya njia hii zilionyesha uanzishaji wa mapema wa unukuzi. Asilitransferasi zinazochukua jukumu katika mkusanyiko wa mwisho wa phenolamide, kama vile AT1, DH29, na CV86, zinaonyesha muundo wa muda mrefu wa ongezeko la udhibiti (Mchoro S4). Uchunguzi hapo juu unaonyesha kwamba uanzishaji wa mapema wa utaalamu wa transcriptome na uboreshaji wa baadaye wa utaalamu wa metabolomiki ni hali iliyounganishwa, ambayo inaweza kuwa kutokana na mfumo wa udhibiti sanjari unaoanzisha mwitikio wenye nguvu wa ulinzi.
Urekebishaji upya katika uashiriaji wa homoni za mimea hufanya kazi kama safu ya udhibiti inayounganisha taarifa za mimea ili kupanga upya fiziolojia ya mimea. Baada ya simulizi ya mimea, tulipima mienendo ya jumla ya kategoria muhimu za homoni za mimea na kuibua taswira ya ushirikiano wa muda kati yao [Mgawo wa uwiano wa Pearson (PCC)> 0.4] (Mchoro 3A). Kama ilivyotarajiwa, homoni za mimea zinazohusiana na usanisi wa kibiolojia zimeunganishwa ndani ya mtandao wa ushirikiano wa usemi wa homoni za mimea. Kwa kuongezea, umaalumu wa kimetaboliki (kielezo cha Si) umeunganishwa kwenye mtandao huu ili kuonyesha homoni za mimea zinazosababishwa na matibabu tofauti. Maeneo mawili makuu ya mwitikio maalum wa mimea yamechorwa: moja iko kwenye kundi la JA, ambapo JA (umbo lake linalofanya kazi kibiolojia JA-Ile) na derivatives zingine za JA zinaonyesha alama ya juu zaidi ya Si; nyingine ni ethilini (ET). Gibberellin ilionyesha ongezeko la wastani tu la umaalumu wa mimea, huku homoni zingine za mimea, kama vile saitokinin, auxin, na asidi ya abscisic, zilikuwa na umaalumu mdogo wa uanzishaji kwa mimea ya mimea. Ikilinganishwa na kutumia W + W pekee, ongezeko la thamani ya kilele cha derivatives za JA kupitia programu ya OS (W + OS) kimsingi linaweza kubadilishwa kuwa kiashiria maalum cha JA. Bila kutarajia, OSM na OSS1 zenye kiwango tofauti cha kichocheo zinajulikana kusababisha mkusanyiko sawa wa JA na JA-Ile. Tofauti na OSS1, OSM husababishwa haswa na kwa nguvu na OSM, huku OSS1 ikiongeza mwitikio wa majeraha ya msingi (Mchoro 3B).
(A) Uchambuzi wa mtandao wa usemi-ulinganifu kulingana na hesabu ya PCC ya simulizi ya kinetiki ya mkusanyiko wa homoni za mimea inayosababishwa na mimea inayokula mimea. Nodi inawakilisha homoni moja ya mmea, na ukubwa wa nodi unawakilisha faharisi ya Si maalum kwa homoni ya mmea kati ya matibabu. (B) Mkusanyiko wa JA, JA-Ile na ET katika majani yanayosababishwa na matibabu tofauti yanayoonyeshwa na rangi tofauti: parachichi, W + OSM; bluu, W + OSSl; nyeusi, W + W; kijivu, C (udhibiti). Nyota zinaonyesha tofauti kubwa kati ya matibabu na udhibiti (ANOVA ya njia mbili ikifuatiwa na ulinganisho mwingi wa Tukey HSD baada ya hoc, *** P <0.001). Uchambuzi wa nadharia ya taarifa ya (C)697 MS/MS (faili ya data S1) katika biosynthesis ya JA na wigo wa utambuzi usioharibika (irAOC na irCOI1) na (D)585 MS/MS (faili ya data S1) katika ETR1 yenye ishara ya ET isiyoharibika Matibabu mawili ya mimea inayokula mimea yaliyoigwa yalisababisha mistari ya mimea na mimea tupu ya kudhibiti magari (EV). Nyota zinaonyesha tofauti kubwa kati ya matibabu ya W+OS na udhibiti usioharibika (ANOVA ya njia mbili ikifuatiwa na ulinganisho mwingi wa Tukey HSD baada ya hoc, *P<0.05, **P<0.01 na ***P<0.001). (E) Grafu zilizotawanyika za upinzani uliotawanyika dhidi ya utaalamu. Rangi zinawakilisha aina tofauti zilizobadilishwa vinasaba; alama zinawakilisha mbinu tofauti za matibabu: pembetatu, W + OSS1; mstatili, W + OSM; duara C
Kisha, tunatumia aina iliyobadilishwa vinasaba ya Nepenthes zilizopunguzwa (irCOI1 na sETR1) katika hatua muhimu za biosynthesis ya JA na ET (irAOC na irACO) na utambuzi (irCOI1 na sETR1) kuchambua kimetaboliki ya homoni hizi mbili za mimea kwenye mimea ya walao majani. Mchango wa jamaa wa upangaji upya. Sambamba na majaribio ya awali, tulithibitisha uanzishaji wa herbivore-OS katika mimea tupu ya kubeba (EV) (Mchoro 3, C hadi D) na kupungua kwa jumla kwa faharisi ya Hj inayosababishwa na OSM, huku faharisi ya δj ikiongezeka. Mwitikio unaonekana zaidi kuliko mwitikio unaosababishwa na OSS1. Grafu ya mistari miwili inayotumia Hj na δj kama viwianishi inaonyesha upungufu maalum wa udhibiti (Mchoro 3E). Mwelekeo dhahiri zaidi ni kwamba katika aina zisizo na ishara ya JA, utofauti wa kimetaboliki na mabadiliko ya utaalamu yanayosababishwa na mimea ya walao majani karibu yameondolewa kabisa (Mchoro 3C). Kwa upande mwingine, mtazamo wa kimya wa ET katika mimea ya sETR1, ingawa athari ya jumla kwenye mabadiliko katika kimetaboliki ya mimea inayokula mimea ni ndogo sana kuliko ile ya ishara ya JA, hupunguza tofauti katika viashiria vya Hj na δj kati ya msisimko wa OSM na OSS1 (Mchoro 3D na Mchoro S5). . Hii inaonyesha kwamba pamoja na kazi kuu ya uhamishaji wa ishara ya JA, uhamishaji wa ishara ya ET pia hutumika kama urekebishaji mzuri wa mwitikio wa kimetaboliki wa spishi maalum za wanyama wanaokula mimea. Sambamba na kazi hii ya urekebishaji mzuri, hakukuwa na mabadiliko katika uwezeshaji wa kimetaboliki kwa ujumla katika mimea ya sETR1. Kwa upande mwingine, ikilinganishwa na mimea ya sETR1, mimea ya irACO ilisababisha amplitude sawa za jumla za mabadiliko ya kimetaboliki yanayosababishwa na wanyama wanaokula mimea, lakini ilionyesha alama tofauti za Hj na δj kati ya changamoto za OSM na OSS1 (Mchoro S5).
Ili kutambua metaboliti maalum ambazo zina michango muhimu kwa mwitikio maalum wa spishi za wanyama walao majani na kuboresha uzalishaji wao kupitia ishara za ET, tulitumia mbinu ya MS/MS iliyotengenezwa hapo awali. Njia hii inategemea mbinu ya makundi mawili ili kutathmini upya familia ya kimetaboliki kutoka kwa vipande vya MS/MS [bidhaa ya nukta iliyorekebishwa (NDP)] na alama ya kufanana kulingana na upotevu wa upande wowote (NL). Seti ya data ya MS/MS iliyojengwa kupitia uchanganuzi wa mistari ya ET iliyobadilishwa jeni ilitoa MS/MS 585 (faili ya data S1), ambayo ilitatuliwa kwa kuziunganisha katika moduli saba kuu za MS/MS (M) (Mchoro 4A). Baadhi ya moduli hizi zimejaa metaboliti maalum zilizobainishwa hapo awali: kwa mfano, M1, M2, M3, M4 na M7 zina utajiri wa derivatives mbalimbali za fenoli (M1), glycosides za flavonoid (M2), sukari za asili (M3 Na M4), na 17-HGL-DTG (M7). Kwa kuongezea, taarifa maalum ya kimetaboliki (kielezo cha Si) cha kimetaboliki moja katika kila moduli huhesabiwa, na usambazaji wake wa Si unaweza kuonekana kwa njia ya kiakili. Kwa kifupi, spektra za MS/MS zinazoonyesha umaalumu wa juu wa mimea na aina ya jeni zina sifa ya thamani kubwa za Si, na takwimu za kurtosis zinaonyesha usambazaji wa manyoya kwenye kona ya kulia ya mkia. Usambazaji mmoja kama huo wa kolloidi konda uligunduliwa katika M1, ambapo fenoli amide ilionyesha sehemu ya juu zaidi ya Si (Mchoro 4B). 17-HGL-DTG inayoweza kufyonzwa na mimea iliyotajwa hapo awali katika M7 ilionyesha alama ya wastani ya Si, ikionyesha kiwango cha wastani cha udhibiti tofauti kati ya aina mbili za OS. Kwa upande mwingine, metaboliti nyingi maalum zinazozalishwa kwa pamoja, kama vile rutin, CGA, na sukari ya asili, ni miongoni mwa alama za chini kabisa za Si. Ili kuchunguza vyema ugumu wa kimuundo na usambazaji wa Si kati ya metaboliti maalum, mtandao wa molekuli ulijengwa kwa kila moduli (Mchoro 4B). Utabiri muhimu wa nadharia ya OD (iliyofupishwa katika Mchoro 1B) ni kwamba upangaji upya wa metaboli maalum baada ya mimea ya mimea unapaswa kusababisha mabadiliko ya njia moja katika metaboli zenye thamani kubwa ya ulinzi, hasa kwa kuongeza umaalum wao (kinyume na usambazaji nasibu) Hali) Kimetaboli ya kujihami iliyotabiriwa na nadharia ya MT. Viungo vingi vya fenoli vilivyokusanywa katika M1 vinahusiana kivitendo na kupungua kwa utendaji wa wadudu (32). Tulipolinganisha thamani za Si katika metaboli za M1 kati ya majani yaliyosababishwa na majani yaliyojumuishwa katika mimea ya kudhibiti EV katika saa 24, tuliona kwamba umaalum wa kimetaboli wa metaboli nyingi baada ya wadudu wa mimea ya mimea ya kudhibiti mimea una mwelekeo unaoongezeka sana (Mchoro 4C). Ongezeko maalum la thamani ya Si liligunduliwa tu katika fenoli za kujihami, lakini hakuna ongezeko la thamani ya Si lililogunduliwa katika fenoli zingine na metaboli zisizojulikana zinazoishi katika moduli hii. Huu ni mfumo maalum, ambao unahusiana na nadharia ya OD. Utabiri mkuu wa mabadiliko ya kimetaboliki yanayosababishwa na mimea ya ... Ili kujaribu kama upekee huu wa spektrojeni ya fenolamide ulisababishwa na ET maalum ya OS, tulichora faharisi ya metaboliti ya Si na kusababisha thamani tofauti ya usemi kati ya OSM na OSS1 katika jenotipu za EV na sETR1 (Mchoro 4D). Katika sETR1, tofauti iliyosababishwa na phenamide kati ya OSM na OSS1 ilipunguzwa sana. Mbinu ya kukusanyika kwa bi-clustering pia ilitumika kwa data ya MS/MS iliyokusanywa katika aina zisizo na JA ya kutosha kukisia moduli kuu za MS/MS zinazohusiana na utaalamu wa kimetaboliki unaodhibitiwa na JA (Mchoro S6).
(A) Matokeo ya makundi ya 585 MS/MS kulingana na kipande kilichoshirikiwa (ufanano wa NDP) na upotezaji wa neutral ulioshirikiwa (ufanano wa NL) husababisha moduli (M) kuwa sawa na familia ya kiwanja kinachojulikana, au kwa muundo wa Metabolite usiojulikana au uliochemshwa vibaya. Karibu na kila moduli, usambazaji maalum wa metabolite (MS/MS) (Si) unaonyeshwa. (B) Mtandao wa moduli wa molekuli: Nodi zinawakilisha MS/MS na kingo, alama za NDP (nyekundu) na NL (bluu) MS/MS (mkata,> 0.6). Kielezo maalum cha metabolite kilichopangwa (Si) kimepakwa rangi kulingana na moduli (kushoto) na kuunganishwa na mtandao wa molekuli (kulia). (C) Moduli M1 ya mmea wa EV katika hali ya uundaji (udhibiti) na iliyosababishwa (uigaji wa mimea inayoliwa) katika saa 24: mchoro wa mtandao wa molekuli (Thamani ya Si ni ukubwa wa nodi, fenolamide ya kujihami imeangaziwa kwa bluu). (D) Mchoro wa mtandao wa molekuli wa M1 wa mstari wa wigo sETR1 wenye utambuzi usiofaa wa EV na ET: kiwanja cha fenoliki kinachowakilishwa na nodi ya duara la kijani, na tofauti kubwa (thamani ya P) kati ya matibabu ya W + OSM na W + OSS1 kama ukubwa wa Nodi. CP, N-caffeoyl-tyrosine; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, N-asidi ya ferulic ester-uric; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tyrosine; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum katika wolfberry Son; Nick. O-AS, O-acyl sugar.
Tuliongeza zaidi uchanganuzi kutoka kwa aina moja ya jeni ya Nepenthes iliyopunguzwa hadi idadi ya asili, ambapo mabadiliko makubwa ya ndani ya viwango vya JA vya walao majani na viwango maalum vya metaboliti yameelezewa hapo awali katika idadi ya asili (26). Tumia seti hii ya data kufunika plazimu 43 za mimea. Plazimu hizi za mimea zinajumuisha spishi 123 za mimea kutoka kwa N. pallens. Mimea hii ilichukuliwa kutoka kwa mbegu zilizokusanywa katika makazi tofauti ya asili huko Utah, Nevada, Arizona, na California (Mchoro S7), tulihesabu utofauti wa metabolomu (hapa huitwa kiwango cha idadi ya watu) utofauti wa β) na utaalamu unaosababishwa na OSM. Sambamba na tafiti zilizopita, tuliona mabadiliko mbalimbali ya kimetaboliki kando ya mihimili ya Hj na δj, ikionyesha kwamba plazimu za mimea zina tofauti kubwa katika unyumbufu wa majibu yao ya kimetaboliki kwa walao majani (Mchoro S7). Shirika hili linakumbusha uchunguzi wa awali kuhusu aina mbalimbali za mabadiliko ya JA yanayosababishwa na walao majani, na limedumisha thamani kubwa sana katika idadi moja ya watu (26, 36). Kwa kutumia JA na JA-Ile kujaribu uhusiano wa jumla wa kiwango kati ya Hj na δj, tuligundua kuwa kuna uhusiano mzuri kati ya JA na faharisi ya utofauti wa metabolome β na utaalamu (Mchoro S7). Hii inaonyesha kwamba tofauti zinazosababishwa na mimea ya mimea katika uanzishaji wa JA unaogunduliwa katika kiwango cha idadi ya watu zinaweza kuwa ni kutokana na polimofimu muhimu za kimetaboliki zinazosababishwa na uteuzi kutoka kwa wadudu wa mimea ya mimea.
Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa aina za tumbaku hutofautiana sana katika utegemezi wa aina na jamaa kwenye ulinzi wa kimetaboliki unaosababishwa na unaojumuisha. Inaaminika kuwa mabadiliko haya katika upitishaji wa ishara za kupambana na walaji mimea na uwezo wa ulinzi yanadhibitiwa na shinikizo la idadi ya wadudu, mzunguko wa maisha ya mimea, na gharama za uzalishaji wa ulinzi katika niche ambapo spishi fulani hukua. Tulisoma uthabiti wa urekebishaji wa metabolome ya majani unaosababishwa na walaji mimea wa spishi sita za Nicotiana asilia Amerika Kaskazini na Amerika Kusini. Spishi hizi zina uhusiano wa karibu na Nepenthes Amerika Kaskazini, ambazo ni Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. nyasi zilizopunguzwa, Nicotiana tabacum, tumbaku ya mstari, tumbaku (Nicotiana spegazzinii) na tumbaku ya majani ya tumbaku (Nicotiana obtusifolia) (Mchoro 5A) (37). Sita kati ya spishi hizi, ikiwa ni pamoja na spishi N. zilizo na sifa nzuri, ni mimea ya kila mwaka ya petunia clade, na obtusifolia N. ni mimea ya kudumu ya dada clade Trigonophyllae (38). Baadaye, uanzishaji wa W + W, W + OSM na W + OSS1 ulifanywa kwenye spishi hizi saba ili kusoma mpangilio mpya wa kimetaboliki wa kiwango cha spishi wa ulishaji wa wadudu.
(A) Mti wa phylogenetic wa bootstrap kulingana na uwezekano mkubwa [kwa usanisi wa glutamine ya nyuklia (38)] na usambazaji wa kijiografia wa spishi saba zinazohusiana kwa karibu za Nicotiana (rangi tofauti) (37). (B) Mchoro wa kutawanyika wa utofauti maalum kwa wasifu wa kimetaboliki wa spishi saba za Nicotiana (939 MS/MS; faili ya data S1). Katika kiwango cha spishi, utofauti wa metabolomu unahusiana vibaya na kiwango cha utaalamu. Uchambuzi wa uhusiano wa kiwango cha spishi kati ya utofauti wa kimetaboliki na utaalamu na mkusanyiko wa JA unaonyeshwa kwenye Mchoro 2. S9. Rangi, aina tofauti; pembetatu, W + OSS1; mstatili, W + OSM; (C) Mienendo ya Nicotiana JA na JA-Ile imepangwa kulingana na amplitude ya msisimko wa OS (ulinganisho wa ANOVA wa njia mbili na Tukey HSD baada ya wingi, * P <0.05, ** P <0.01 na * ** Kwa kulinganisha W + OS na W + W, P <0.001). Mchoro wa kisanduku cha (D) utofauti na (E) utaalamu wa kila spishi baada ya kuiga mimea ya majani na methyl JA (MeJA). Kinyota kinaonyesha tofauti kubwa kati ya W + OS na W + W au lanolini pamoja na W (Lan + W) au Lan pamoja na MeJA (Lan + MeJa) na udhibiti wa Lan (uchambuzi wa tofauti wa pande mbili, ikifuatiwa na ulinganisho mwingi wa Tukey wa HSD baada ya hoc, *P<0.05, **P<0.01 na ***P<0.001).
Kwa kutumia mbinu ya nguzo mbili, tulitambua moduli 9 za 939 MS/MS (faili la data S1). Muundo wa MS/MS uliobadilishwa na matibabu tofauti hutofautiana sana kati ya moduli tofauti kati ya spishi (Mchoro S8). Kuona Hj (inayojulikana hapa kama utofauti wa γ-kiwango cha spishi) na δj kunaonyesha kwamba spishi tofauti hukusanyika katika vikundi tofauti sana katika nafasi ya kimetaboliki, ambapo mgawanyiko wa kiwango cha spishi kwa kawaida huwa maarufu zaidi kuliko msisimko. Isipokuwa N. linear na N. obliquus, zinaonyesha aina mbalimbali za athari za uanzishaji (Mchoro 5B). Kwa upande mwingine, spishi kama vile N. purpurea na N. obtusifolia zina mwitikio wa kimetaboliki usio dhahiri kwa matibabu, lakini metabolome ni tofauti zaidi. Usambazaji maalum wa spishi wa mwitikio wa kimetaboliki uliosababishwa ulisababisha uhusiano hasi mkubwa kati ya utaalamu na utofauti wa gamma (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). Mabadiliko yanayosababishwa na OS katika viwango vya JA yanahusiana vyema na utaalamu wa metabolomu, na yanahusiana vibaya na utofauti wa gamma ya kimetaboliki unaoonyeshwa na kila spishi (Mchoro 5B na Mchoro S9). Ni muhimu kuzingatia kwamba spishi zinazojulikana kimapokeo kama spishi za "mwitikio wa ishara" katika Mchoro 5C, kama vile nematodi za Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute, na Nepenthes zilizopunguzwa, zilisababisha dalili muhimu katika dakika 30. Milipuko ya hivi karibuni ya JA na JA-Ile maalum ya OS, huku bakteria wengine wakiitwa "signal responsive", kama vile Nepenthes mills, Nepenthes powdery na N. obtusifolia zinaonyesha tu uanzishaji wa JA-Ile Edge bila umaalum wowote wa OS (Mchoro 5C). Katika kiwango cha kimetaboliki, kama ilivyotajwa hapo juu, kwa Nepenthes zilizopunguzwa, vitu vinavyoitikia ishara vilionyesha umaalum wa OS na viliongeza kwa kiasi kikubwa δj, huku vikipunguza Hj. Athari hii ya utangulizi maalum wa OS haikugunduliwa katika spishi zilizoainishwa kama spishi zisizo tendaji za ishara (Mchoro 5, D na E). Metaboliti maalum za OS hushirikiwa mara nyingi zaidi kati ya spishi zinazoitikia ishara, na makundi haya ya ishara hukusanyika na spishi zenye majibu dhaifu ya ishara, huku spishi zenye majibu dhaifu ya ishara zikionyesha utegemezi mdogo (Mchoro S8). Matokeo haya yanaonyesha kwamba uanzishaji maalum wa OS wa JA na usanidi mpya maalum wa OS wa metabolome ya chini ya mto vimeunganishwa katika kiwango cha spishi.
Kisha, tulitumia mchanganyiko wa lanolini ulio na methyl JA (MeJA) kutibu mimea ili kuchunguza kama njia hizi za kuunganisha zimezuiliwa na upatikanaji wa JA inayotumiwa na JA ya nje, ambayo itakuwa kwenye saitoplazimu ya mimea. Uharibifu wa haraka wa JA ni JA. Tulipata mwelekeo uleule wa mabadiliko ya taratibu kutoka kwa spishi zinazoitikia ishara hadi spishi zisizoitikia ishara zinazosababishwa na usambazaji endelevu wa JA (Mchoro 5, D na E). Kwa kifupi, matibabu ya MeJA yalibadilisha sana metabolomu za nematodi za mstari, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, na N. mikimotoi, na kusababisha ongezeko kubwa la δj na kupungua kwa Hj. N. purpurea kulionyesha tu ongezeko la δj, lakini si Hj. N. obtusifolia, ambayo hapo awali imeonyeshwa kukusanya viwango vya chini sana vya JA, pia huitikia vibaya matibabu ya MeJA katika suala la usanidi upya wa metabolomu. Matokeo haya yanaonyesha kuwa uzalishaji wa JA au uhamishaji wa ishara umezuiliwa kisaikolojia katika spishi zisizoitikia ishara. Ili kujaribu dhana hii, tulisoma spishi nne (N. pallens, N. mills, N. pink na N. microphylla) zinazosababishwa na W + W, W + OSM na W + OSS1 Transcriptome (39). Sambamba na muundo wa urekebishaji wa metabolome, spishi zimetenganishwa vizuri katika nafasi ya transcriptome, kati ya hizo N. zilizopunguzwa zilionyesha RDPI ya juu zaidi inayosababishwa na OS, huku N. gracilis ikiwa na ya chini kabisa (Mchoro 6A). Hata hivyo, iligundulika kuwa utofauti wa transcriptome unaosababishwa na N. oblonga ulikuwa wa chini kabisa kati ya spishi nne, kinyume na utofauti wa juu zaidi wa kimetaboliki wa N. oblonga ulioonyeshwa hapo awali katika spishi saba. Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa seti ya jeni zinazohusiana na ishara za mapema za ulinzi, ikiwa ni pamoja na ishara za JA, inaelezea umaalumu wa majibu ya mapema ya ulinzi yanayosababishwa na vichochezi vinavyohusiana na walaji mimea katika spishi za Nicotiana (39). Kulinganisha njia za ishara za JA kati ya spishi hizi nne kulionyesha muundo wa kuvutia (Mchoro 6B). Jeni nyingi katika njia hii, kama vile AOC, OPR3, ACX na COI1, zilionyesha viwango vya juu vya uanzishaji katika spishi hizi nne. Hata hivyo, jeni muhimu, JAR4, hubadilisha JA kuwa aina yake hai ya kibiolojia ya nakala zilizokusanywa za JA-Ile, na kiwango chake cha unukuzi ni cha chini sana, haswa katika N. mills, Nepenthes pieris na N. microphylla. Kwa kuongezea, ni nakala ya jeni nyingine AOS pekee ambayo haikugunduliwa katika N. bifidum. Mabadiliko haya katika usemi wa jeni yanaweza kuwajibika kwa fenotipu kali zinazosababishwa na uzalishaji mdogo wa JA katika spishi zisizo na mzio wa ishara na uanzishaji wa N. gracilis.
(A) Uchambuzi wa nadharia ya taarifa kuhusu upangaji upya wa majibu ya awali ya unukuzi wa spishi nne za tumbaku zinazohusiana kwa karibu zilizochukuliwa sampuli dakika 30 baada ya uanzishaji wa mimea ya mimea. RDPI huhesabiwa kwa kulinganisha majani yaliyosababishwa na mfumo wa uendeshaji wa mimea ya mimea na udhibiti wa jeraha. Rangi zinaonyesha spishi tofauti, na alama zinaonyesha mbinu tofauti za matibabu. (B) Uchambuzi wa usemi wa jeni katika njia za kuashiria JA miongoni mwa spishi nne. Njia iliyorahisishwa ya JA imeonyeshwa karibu na mchoro wa kisanduku. Rangi tofauti zinaonyesha mbinu tofauti za usindikaji. Kinyota kinaonyesha kuwa kuna tofauti kubwa kati ya matibabu ya W + OS na udhibiti wa W + W (kwa jaribio la t la Mwanafunzi kwa tofauti za jozi, *P<0.05, **P<0.01 na ***P<0.001). OPDA, asidi 12-oxophytodienoic; OPC-8: asidi 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic.
Katika sehemu ya mwisho, tulisoma jinsi urekebishaji maalum wa spishi za wadudu wa metabolome ya spishi tofauti za mimea unavyoweza kuwa sugu kwa wala majani. Utafiti uliopita ulisisitiza jenasi ya Nicotiana. Upinzani wao kwa Bi na mabuu hutofautiana sana (40). Hapa, tulisoma uhusiano kati ya mfumo huu na unyumbufu wao wa kimetaboliki. Kwa kutumia spishi nne za tumbaku zilizo hapo juu, na kujaribu uhusiano kati ya utofauti na utaalamu wa metabolome unaosababishwa na wala majani na upinzani wa mimea kwa Bi na Sl, tuligundua kuwa upinzani, utofauti na utaalamu kwa Sl All ya jumla una uhusiano chanya, huku uhusiano kati ya upinzani kwa wanawake wataalamu na utaalamu ni dhaifu, na uhusiano na utofauti si muhimu (Mchoro S10). Kuhusu upinzani wa S1, N. chinensis na N. gracilis zote mbili zilizopungua, ambazo hapo awali zilionyeshwa kuonyesha viwango vya upitishaji wa ishara za JA na unyumbufu wa metabolome, zilikuwa na majibu tofauti sana kwa uanzishaji wa wala majani, na pia zilionyesha upinzani sawa wa juu. Jinsia.
Katika miaka sitini iliyopita, nadharia ya ulinzi wa mimea imetoa mfumo wa kinadharia, kulingana na ambayo watafiti wametabiri idadi kubwa ya mageuzi na kazi za metaboliti maalum za mimea. Nadharia nyingi hizi hazifuati utaratibu wa kawaida wa hitimisho kali (41). Zinapendekeza utabiri muhimu (3) katika kiwango sawa cha uchambuzi. Wakati upimaji wa utabiri muhimu unaruhusu nadharia maalum kuchanganuliwa, hii itafanya uwanja kusonga mbele. Kuungwa mkono, lakini kataa zingine (42). Badala yake, nadharia mpya hufanya utabiri katika viwango tofauti vya uchambuzi na huongeza safu mpya ya mambo ya kuelezea (42). Hata hivyo, nadharia mbili zilizopendekezwa katika kiwango cha utendaji kazi, MT na OD, zinaweza kuelezewa kwa urahisi kama utabiri muhimu wa mabadiliko maalum ya kimetaboliki yanayosababishwa na wanyama walao majani: Nadharia ya OD inaamini kwamba mabadiliko katika "nafasi" maalum ya kimetaboliki yana mwelekeo mkubwa. Nadharia ya MT inaamini kwamba mabadiliko haya hayatakuwa ya mwelekeo na yatapatikana kwa nasibu katika nafasi ya kimetaboliki, na huwa na metaboliti zenye thamani kubwa ya ulinzi. Uchunguzi wa awali wa utabiri wa OD na MT umejaribiwa kwa kutumia seti nyembamba ya misombo ya "ulinzi" ya awali. Vipimo hivi vya metaboliti huzuia uwezo wa kuchambua kiwango na mwelekeo wa usanidi upya wa metaboliti wakati wa mimea, na haviruhusu majaribio ndani ya mfumo thabiti wa takwimu kuhitaji utabiri muhimu ambao unaweza kuzingatiwa kwa ujumla. Pima mabadiliko katika metaboliti ya mimea. Hapa, tulitumia teknolojia bunifu katika metaboliti kulingana na MS ya kompyuta na kufanya uchambuzi wa deconvolution MS katika sarafu ya jumla ya maelezo ya nadharia ya habari ili kujaribu tofauti kati ya hizo mbili zilizopendekezwa katika kiwango cha metaboliti cha kimataifa. Utabiri muhimu wa nadharia hii. Nadharia ya habari imetumika katika nyanja nyingi, haswa katika muktadha wa bioanuwai na utafiti wa mtiririko wa virutubisho (43). Hata hivyo, kwa kadiri tunavyojua, hii ndiyo matumizi ya kwanza yanayotumika kuelezea nafasi ya habari ya kimetaboliki ya mimea na kutatua matatizo ya kiikolojia yanayohusiana na mabadiliko ya muda ya kimetaboliki katika kukabiliana na dalili za mazingira. Hasa, uwezo wa njia hii uko katika uwezo wake wa kulinganisha mifumo ndani na kati ya spishi za mimea ili kuchunguza jinsi wanyama walao majani wamebadilika kutoka spishi tofauti hadi mifumo ya mageuko makubwa ya kati ya spishi katika viwango tofauti vya mageuko. Metabolismi.
Uchambuzi wa vipengele vikuu (PCA) hubadilisha seti ya data yenye mabadiliko mengi kuwa nafasi ya kupunguza vipimo ili mwelekeo mkuu wa data uweze kuelezewa, kwa hivyo kwa kawaida hutumika kama mbinu ya uchunguzi ili kuchanganua seti ya data, kama vile metabolome ya kuondoa msongamano. Hata hivyo, upunguzaji wa vipimo utapoteza sehemu ya maudhui ya taarifa katika seti ya data, na PCA haiwezi kutoa taarifa za kiasi kuhusu sifa zinazofaa hasa kwa nadharia ya ikolojia, kama vile: jinsi wanyama walao majani wanavyorekebisha utofauti katika nyanja maalum (kwa mfano, utajiri, usambazaji) Na wingi) metaboliti? Ni metaboliti zipi zinazotabiri hali inayosababishwa ya wanyama walao majani fulani? Kwa mtazamo wa umaalum, utofauti na kutoweza kushawishika, maudhui ya taarifa ya wasifu wa metaboliti maalum ya jani hutengana, na imegundulika kuwa kula wanyama walao majani kunaweza kuamsha kimetaboliki maalum. Bila kutarajia, tuliona kwamba, kama ilivyoelezwa katika viashiria vya nadharia ya habari vilivyotekelezwa, hali ya kimetaboliki inayotokana ina mwingiliano mkubwa baada ya mashambulizi ya wanyama wawili walao majani (Sl anayelishwa usiku) na mtaalamu wa Solanaceae Bi. Ingawa tabia yao ya kulisha na mkusanyiko ni tofauti sana. Kianzishaji cha asidi-amino asidi ya mafuta (FAC) katika OS (31). Kwa kutumia OS ya walao majani kutibu majeraha ya kutoboa sanifu, matibabu ya walao majani yaliyoigwa pia yalionyesha mwelekeo sawa. Utaratibu huu sanifu wa kuiga mwitikio wa mimea kwa mashambulizi ya walao majani huondoa mambo yanayochanganya yanayosababishwa na mabadiliko katika tabia ya kula ya wanyama walao majani, ambayo husababisha viwango tofauti vya uharibifu kwa nyakati tofauti (34). FAC, ambayo inajulikana kuwa chanzo kikuu cha OSM, hupunguza JAS na majibu mengine ya homoni za mimea katika OSS1, huku OSS1 ikipunguza mamia ya mara (31). Hata hivyo, OSS1 ilisababisha viwango sawa vya mkusanyiko wa JA ikilinganishwa na OSM. Imeonyeshwa hapo awali kwamba mwitikio wa JA katika Nepenthes zilizopunguzwa ni nyeti sana kwa OSM, ambapo FAC inaweza kudumisha shughuli zake hata ikiwa imepunguzwa 1:1000 na maji (44). Kwa hivyo, ikilinganishwa na OSM, ingawa FAC katika OSS1 ni ndogo sana, inatosha kusababisha mlipuko wa JA wa kutosha. Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa protini kama porini (45) na oligosaccharides (46) zinaweza kutumika kama dalili za molekuli kusababisha majibu ya ulinzi wa mimea katika OSS1. Hata hivyo, bado haijulikani wazi ikiwa vichocheo hivi katika OSS1 vinahusika na mkusanyiko wa JA unaoonekana katika utafiti wa sasa.
Ingawa kuna tafiti chache zinazoelezea alama tofauti za vidole vya kimetaboliki zinazosababishwa na matumizi ya wanyama tofauti wanaokula mimea au JA au SA ya nje (salicylic acid) (47), hakuna mtu aliyesumbua usumbufu maalum wa spishi za mimea katika mtandao wa nyasi za mimea na athari zake kwa taarifa za kibinafsi. Uchambuzi huu ulithibitisha zaidi kwamba muunganisho wa mtandao wa ndani wa homoni na homoni zingine za mimea isipokuwa JA huunda umahususi wa upangaji upya wa kimetaboliki unaosababishwa na wanyama wanaokula mimea. Hasa, tuligundua kuwa ET inayosababishwa na OSM ilikuwa kubwa zaidi kuliko ile inayosababishwa na OSS1. Hali hii inaendana na kiwango cha FAC zaidi katika OSM, ambayo ni sharti muhimu na la kutosha la kusababisha mlipuko wa ET (48). Katika muktadha wa mwingiliano kati ya mimea na wanyama wanaokula mimea, kazi ya kuashiria ya ET kwenye mienendo ya kimetaboliki maalum ya mimea bado ni ya hapa na pale na inalenga kundi moja tu la kiwanja. Kwa kuongezea, tafiti nyingi zimetumia matumizi ya nje ya ET au vitangulizi vyake au vizuizi mbalimbali ili kusoma udhibiti wa ET, ambayo miongoni mwao matumizi haya ya kemikali ya nje yatatoa athari nyingi zisizo maalum. Kwa ufahamu wetu, utafiti huu unawakilisha uchunguzi wa kwanza mkubwa wa kimfumo wa jukumu la ET katika matumizi ya ET kuzalisha na kutambua mimea iliyobadilishwa jeni iliyoharibika ili kuratibu mienendo ya metabolome ya mimea. Uingizaji wa ET maalum kwa mimea ya mimea unaweza hatimaye kurekebisha mwitikio wa metabolome. Muhimu zaidi ni ujanja wa transjeni wa jeni za biosynthesis ya ET (ACO) na mtazamo (ETR1) ambazo zilifunua mkusanyiko mpya wa phenolamides maalum kwa mimea ya mimea. Imeonyeshwa hapo awali kuwa ET inaweza kurekebisha mkusanyiko wa nikotini unaosababishwa na JA kwa kudhibiti putrescine N-methyltransferase (49). Hata hivyo, kutoka kwa mtazamo wa kiufundi, haijulikani wazi jinsi ET inavyorekebisha uingizwaji wa phenamide. Mbali na kazi ya upitishaji wa ishara ya ET, mtiririko wa kimetaboliki unaweza pia kuhamishwa hadi S-adenosyl-1-methionine ili kudhibiti uwekezaji katika amidi za poliaminofenoli. S-adenosyl-1-methionine ni ET na njia ya kawaida ya njia ya biosynthetic ya poliamini. Utaratibu ambao ishara ya ET hudhibiti kiwango cha fenolamide unahitaji utafiti zaidi.
Kwa muda mrefu, kutokana na idadi kubwa ya metaboliti maalum za muundo usiojulikana, umakini mkubwa kwa kategoria maalum za kimetaboliki haujaweza kutathmini kwa ukamilifu mabadiliko ya muda ya utofauti wa kimetaboliki baada ya mwingiliano wa kibiolojia. Kwa sasa, kulingana na uchambuzi wa nadharia ya habari, matokeo kuu ya upatikanaji wa wigo wa MS/MS kulingana na metaboliti zisizo na upendeleo ni kwamba wanyama walao majani wanaokula au kuiga wanyama walao majani wanaendelea kupunguza utofauti wa kimetaboliki wa metaboliti ya jani huku wakiongeza kiwango chake cha utaalamu. Ongezeko hili la muda la umaalumu wa metaboliti unaosababishwa na wanyama walao majani linahusishwa na ongezeko la ushirikiano katika umaalumu wa transcriptome. Kipengele kinachochangia zaidi utaalamu huu mkubwa wa metaboliti (kuwa na thamani ya juu ya Si) ni metaboliti maalum yenye kazi ya kula majani iliyobainishwa hapo awali. Mfano huu unaendana na utabiri wa nadharia ya OD, lakini utabiri wa MT unaohusiana na nasibu ya upangaji upya wa metaboliti si thabiti. Hata hivyo, data hii pia inaendana na utabiri wa mfumo mchanganyiko (MT bora; Mchoro 1B), kwa sababu metaboliti zingine ambazo hazina sifa zenye kazi za ulinzi zisizojulikana bado zinaweza kufuata usambazaji wa nasibu wa Si.
Muundo unaojulikana zaidi ulionaswa na utafiti huu ni kwamba kuanzia kiwango cha mageuko madogo (mmea mmoja na idadi ya tumbaku) hadi kiwango kikubwa cha mageuko (aina za tumbaku zinazohusiana kwa karibu), viwango tofauti vya mpangilio wa mageuko viko katika "ulinzi bora zaidi". Kuna tofauti kubwa katika uwezo wa wanyama walao majani. Moore et al. (20) na Kessler na Kalske (1) walipendekeza kwa kujitegemea kubadilisha viwango vitatu vya utendaji vya bioanuwai vilivyotofautishwa awali na Whittaker (50) kuwa mabadiliko ya muda na yaliyosababishwa ya utofauti wa kemikali; waandishi hawa hawakutoa muhtasari. Taratibu za ukusanyaji wa data ya metabolomu kwa kiwango kikubwa pia hazionyeshi jinsi ya kuhesabu utofauti wa kimetaboliki kutoka kwa data hizi. Katika utafiti huu, marekebisho madogo katika uainishaji wa utendaji wa Whittaker yatazingatia utofauti wa kimetaboliki wa α kama utofauti wa spektra za MS/MS katika mmea fulani, na utofauti wa kimetaboliki wa β kama kimetaboliki ya msingi ya ndani ya kundi la watu Nafasi, na utofauti wa kimetaboliki wa γ utakuwa mwendelezo wa uchambuzi wa spishi zinazofanana.
Ishara ya JA ni muhimu kwa aina mbalimbali za majibu ya kimetaboliki ya mimea inayokula mimea. Hata hivyo, kuna ukosefu wa upimaji mkali wa kiasi cha mchango wa udhibiti wa ndani wa biosynthesis ya JA kwa utofauti wa metabolome, na kama ishara ya JA ni tovuti ya jumla ya mseto wa kimetaboliki unaosababishwa na msongo wa mawazo kwa kiwango cha juu cha mageuko makubwa bado ni jambo lisiloeleweka. Tuliona kwamba asili ya mimea inayokula mimea ya Nepenthes husababisha utaalamu wa metabolome na tofauti ya utaalamu wa metabolome ndani ya idadi ya spishi za Nicotiana na miongoni mwa spishi zinazohusiana kwa karibu za Nicotiana inahusiana kimfumo na ishara ya JA. Kwa kuongezea, wakati ishara ya JA inapoharibika, umaalumu wa kimetaboliki unaosababishwa na mimea inayokula mimea ya jeni moja utafutwa (Mchoro 3, C na E). Kwa kuwa mabadiliko ya wigo wa kimetaboliki ya idadi ya Nepenthes iliyopunguzwa kiasili kwa kiasi kikubwa ni ya kiasi, mabadiliko katika utofauti wa kimetaboliki wa β na umaalumu katika uchanganuzi huu yanaweza kusababishwa kwa kiasi kikubwa na msisimko mkubwa wa kategoria za misombo yenye metabolome nyingi. Madarasa haya ya misombo yanatawala sehemu ya wasifu wa metabolome na kusababisha uhusiano chanya na ishara za JA.
Kwa sababu mifumo ya kibiokemikali ya spishi za tumbaku zinazohusiana nayo kwa karibu ni tofauti sana, metaboliti hutambuliwa mahsusi katika kipengele cha ubora, kwa hivyo ni ya uchambuzi zaidi. Usindikaji wa nadharia ya habari wa wasifu wa kimetaboliki ulionaswa unaonyesha kwamba uanzishaji wa mimea inayokula mimea huzidisha biashara kati ya utofauti wa kimetaboliki wa gamma na utaalamu. Ishara ya JA ina jukumu kuu katika biashara hii. Ongezeko la utaalamu wa metaboloma linaendana na utabiri mkuu wa OD na linahusiana vyema na ishara ya JA, huku ishara ya JA ikihusiana vibaya na utofauti wa kimetaboliki wa gamma. Mifumo hii inaonyesha kwamba uwezo wa OD wa mimea huamuliwa zaidi na ubadilikaji wa JA, iwe kwa kiwango cha mageuko madogo au kwa kiwango kikubwa cha mageuko. Majaribio ya matumizi ya JA ya nje ambayo huepuka kasoro za usanisi wa JA yanaonyesha zaidi kwamba spishi za tumbaku zinazohusiana kwa karibu zinaweza kutofautishwa katika spishi zinazoitikia ishara na zisizoitikia ishara, kama vile aina yao ya JA na ubadilikaji wa metaboloma unaosababishwa na mimea inayokula mimea. Spishi zisizoitikia ishara haziwezi kujibu kutokana na kutoweza kwao kutoa JA ya asili na kwa hivyo zinakabiliwa na mapungufu ya kisaikolojia. Hii inaweza kusababishwa na mabadiliko katika baadhi ya jeni muhimu katika njia ya ishara ya JA (AOS na JAR4 katika N. crescens). Matokeo haya yanaangazia kwamba mifumo hii ya mageuzi makubwa ya spishi mbalimbali inaweza kuendeshwa hasa na mabadiliko katika mtazamo wa ndani wa homoni na mwitikio.
Mbali na mwingiliano kati ya mimea na wanyama walao majani, uchunguzi wa utofauti wa kimetaboliki unahusiana na maendeleo yote muhimu ya kinadharia katika utafiti wa marekebisho ya kibiolojia kwa mazingira na mageuko ya sifa tata za phenotypic. Kwa kuongezeka kwa kiasi cha data inayopatikana na vyombo vya kisasa vya MS, upimaji wa nadharia kuhusu utofauti wa kimetaboliki sasa unaweza kupita tofauti za kimetaboliki za mtu binafsi/kategoria na kufanya uchambuzi wa kimataifa ili kufichua mifumo isiyotarajiwa. Katika mchakato wa uchambuzi wa kiwango kikubwa, sitiari muhimu ni wazo la kufikiria ramani zenye maana ambazo zinaweza kutumika kuchunguza data. Kwa hivyo, matokeo muhimu ya mchanganyiko wa sasa wa metabolomiki za MS/MS zisizo na upendeleo na nadharia ya habari ni kwamba hutoa kipimo rahisi ambacho kinaweza kutumika kujenga ramani ili kuvinjari utofauti wa kimetaboliki kwenye mizani tofauti ya taksonomia. Ni hitaji la msingi la njia hii. Utafiti wa mageuko madogo/makubwa na ikolojia ya jamii.
Katika kiwango cha mageuzi makubwa, kiini cha nadharia ya mageuzi ya pamoja ya mimea na wadudu ya Ehrlich na Raven (51) ni kutabiri kwamba tofauti za utofauti wa kimetaboliki kati ya spishi ndio sababu ya utofauti wa safu za mimea. Hata hivyo, katika miaka hamsini tangu kuchapishwa kwa kazi hii muhimu, dhana hii haijajaribiwa mara chache (52). Hii ni kwa kiasi kikubwa kutokana na sifa za fiziojenetiki za sifa zinazofanana za kimetaboliki katika safu za mimea za masafa marefu. Uhaba huo unaweza kutumika kushikilia mbinu za uchambuzi wa shabaha. Mtiririko wa sasa wa MS/MS unaosindikwa na nadharia ya habari hupima kufanana kwa kimuundo kwa metaboliti zisizojulikana (bila uteuzi wa metaboliti wa awali) na hubadilisha hizi MS/MS kuwa seti ya MS/MS, hivyo katika metaboli ya kitaalamu Mifumo hii ya mageuzi makubwa hulinganishwa katika kiwango cha uainishaji. Viashiria rahisi vya takwimu. Mchakato huo ni sawa na uchambuzi wa fiziojenetiki, ambao unaweza kutumia mpangilio wa mfuatano kupima kiwango cha utofauti au mageuzi ya tabia bila utabiri wa awali.
Katika kiwango cha kibiokemikali, nadharia ya uchunguzi ya Firn na Jones (53) inaonyesha kwamba utofauti wa kimetaboliki huhifadhiwa katika viwango tofauti ili kutoa malighafi ili kutekeleza shughuli za kibiolojia za metaboliti ambazo hazikuwa na uhusiano wowote au zilizobadilishwa. Mbinu za nadharia ya habari hutoa mfumo ambapo mabadiliko haya ya mageuko maalum ya metaboliti yanayotokea wakati wa utaalamu wa metaboliti yanaweza kupimwa kama sehemu ya mchakato uliopendekezwa wa uchunguzi wa mageuko: marekebisho hai ya kibiolojia kutoka kwa umaalum wa chini hadi umaalum wa juu Metaboliti zilizozuiliwa za mazingira fulani.
Kwa ujumla, katika siku za mwanzo za biolojia ya molekuli, nadharia muhimu za ulinzi wa mimea zilitengenezwa, na mbinu zinazotokana na nadharia tete zinachukuliwa sana kuwa njia pekee ya maendeleo ya kisayansi. Hii ni kwa kiasi kikubwa kutokana na mapungufu ya kiufundi ya kupima metabolomu nzima. Ingawa mbinu zinazotokana na nadharia tete ni muhimu sana katika kuchagua mifumo mingine ya kisababishi, uwezo wao wa kuendeleza uelewa wetu wa mitandao ya kibiokemikali ni mdogo zaidi kuliko mbinu za kompyuta zinazopatikana sasa katika sayansi ya kisasa inayotumia data nyingi. Kwa hivyo, nadharia ambazo haziwezi kutabirika ziko mbali zaidi ya upeo wa data inayopatikana, kwa hivyo fomula/mzunguko wa majaribio ya kinadharia ya maendeleo katika uwanja wa utafiti hauwezi kufutwa (4). Tunaona kuwa mtiririko wa kazi wa kompyuta wa metabolomu unaoletwa hapa unaweza kuamsha tena shauku katika masuala ya hivi karibuni (jinsi) na ya mwisho (kwa nini) ya utofauti wa kimetaboliki, na kuchangia katika enzi mpya ya sayansi ya data inayoongozwa na kinadharia. Enzi hiyo ilichunguza upya nadharia muhimu zilizowahimiza vizazi vilivyopita.
Ulishaji wa moja kwa moja wa wanyama wanaokula mimea hufanywa kwa kuinua lava wa pili wa ndani au lava wa Sl kwenye jani moja la mmea lenye rangi ya hudhurungi la mmea mmoja unaochanua waridi, likiwa na mimea 10 inayofanana kwa kila mmea. Lava wa wadudu walibanwa kwa vibanio, na tishu zilizobaki za jani zilikusanywa saa 24 na 72 baada ya kuambukizwa na kugandishwa haraka, na metaboliti zilitolewa.
Kuiga matibabu ya mimea kwa njia iliyosawazishwa sana. Njia hii ni kutumia magurudumu ya muundo wa kitambaa kutoboa safu tatu za miiba kila upande wa katikati ya majani matatu yaliyopanuka kikamilifu ya mmea wakati wa hatua ya ukuaji wa taji la kitambaa, na mara moja paka 1:5 Diluted Ms. Au tumia vidole vyenye glavu kuingiza S1 OS kwenye jeraha la kutoboa. Vuna na usindika jani kama ilivyoelezwa hapo juu. Tumia njia iliyoelezwa hapo awali kutoa metaboliti za msingi na homoni za mimea (54).
Kwa matumizi ya nje ya JA, majani matatu ya petiole ya kila moja ya mimea sita inayochanua waridi ya kila spishi hutibiwa na 20μl ya lanolin laste yenye 150μg MeJA (Lan + MeJA), na 20μl ya lanolin pamoja na matibabu ya jeraha (Lan + W), au tumia 20μl ya lanolin safi kama udhibiti. Majani yalivunwa saa 72 baada ya matibabu, yaligandishwa kwenye nitrojeni kioevu, na kuhifadhiwa kwa -80°C hadi matumizi.
Mistari minne ya JA na ET iliyobadilishwa jeni, yaani irAOC (36), irCOI1 (55), irACO na sETR1 (48), imetambuliwa katika kundi letu la utafiti. irAOC ilionyesha kwa kiasi kikubwa kupungua kwa viwango vya JA na JA-Ile, huku irCOI1 ikiwa nyeti kwa JA. Ikilinganishwa na EV, mkusanyiko wa JA-Ile uliongezeka. Vile vile, irACO itapunguza uzalishaji wa ET, na ikilinganishwa na EV, sETR1, ambayo hainyeti kwa ET, itaongeza uzalishaji wa ET.
Spektromita ya leza ya mwanga (Sensor Sense ET-300 real-time ET sensor) hutumika kufanya kipimo cha ET bila kuvamia. Mara tu baada ya matibabu, nusu ya majani yalikatwa na kuhamishiwa kwenye chupa ya kioo yenye ujazo wa mililita 4 iliyofungwa, na nafasi ya kichwa iliruhusiwa kujilimbikiza ndani ya saa 5. Wakati wa kipimo, kila chupa ilisafishwa kwa mkondo wa lita 2/saa wa hewa safi kwa dakika 8, ambayo hapo awali ilipitia kichocheo kilichotolewa na Sensor Sense ili kuondoa CO2 na maji.
Data ya mikroarray ilichapishwa awali katika (35) na kuhifadhiwa katika Hifadhidata Kamili ya Usemi wa Jeni ya Kituo cha Kitaifa cha Habari za Bioteknolojia (NCBI) (nambari ya upatanishi GSE30287). Data inayolingana na majani yaliyosababishwa na matibabu ya W + OSM na udhibiti usioharibika ilitolewa kwa ajili ya utafiti huu. Kiwango ghafi ni log2. Kabla ya uchambuzi wa takwimu, msingi ulibadilishwa na kurekebishwa hadi asilimia yake ya 75 kwa kutumia kifurushi cha programu cha R.
Data asilia ya mpangilio wa RNA (RNA-seq) ya spishi za Nicotiana ilipatikana kutoka kwa NCBI Short Reading Archives (SRA), nambari ya mradi ni PRJNA301787, ambayo iliripotiwa na Zhou et al. (39) na kuendelea kama ilivyoelezwa katika (56). Data ghafi iliyosindikwa na W + W, W + OSM na W + OSS1 inayolingana na spishi za Nicotiana ilichaguliwa kwa ajili ya uchambuzi katika utafiti huu, na kusindikwa kwa njia ifuatayo: Kwanza, usomaji ghafi wa RNA-seq ulibadilishwa kuwa umbizo la FASTQ. HISAT2 hubadilisha FASTQ kuwa SAM, na SAMtools hubadilisha faili za SAM kuwa faili za BAM zilizopangwa. StringTie hutumika kukokotoa usemi wa jeni, na mbinu yake ya usemi ni kwamba kuna vipande kwa kila vipande elfu vya msingi kwa kila vipande milioni vya unukuzi vilivyopangwa.
Safu wima ya Acclaim chromatographic (150 mm x 2.1 mm; ukubwa wa chembe 2.2μm) inayotumika katika uchanganuzi na safu wima ya ulinzi ya 4 mm x 4 mm ina nyenzo sawa. Gradient ifuatayo ya binary inatumika katika mfumo wa Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC): dakika 0 hadi 0.5, isocratic 90% A [maji yaliyoondolewa ioni, 0.1% (v/v) asetonitrile na 0.05% asidi fomike], 10% B (Acetonitrile na 0.05% asidi fomike); dakika 0.5 hadi 23.5, awamu ya gradient ni 10% A na 90% B, mtawalia; dakika 23.5 hadi 25, isocratic 10% A na 90% B. Kiwango cha mtiririko ni 400μl/dakika. Kwa uchanganuzi wote wa MS, choma safu wima ya eluent kwenye kichanganuzi cha nne na cha wakati wa kuruka (qTOF) kilicho na chanzo cha kunyunyizia umeme kinachofanya kazi katika hali chanya ya ioni (volteji ya kapilari, 4500 V; njia ya kutoa kapilari 130 V; Joto la kukausha 200°C; mtiririko wa hewa wa kukausha lita 10/dakika).
Fanya uchanganuzi wa vipande vya MS / MS (hapa utajulikana kama MS / MS) ambao hauna maana au hauwezi kutofautishwa na data ili kupata taarifa za kimuundo kuhusu wasifu wa jumla wa kimetaboliki unaoweza kugunduliwa. Wazo la mbinu isiyobagua ya MS/MS inategemea ukweli kwamba quadrupole ina dirisha kubwa sana la kutenganisha wingi [kwa hivyo, fikiria ishara zote za uwiano wa wingi-kwa-chaji (m/z) kama vipande]. Kwa sababu hii, kwa sababu kifaa cha Impact II hakikuweza kuunda mwelekeo wa CE, uchanganuzi kadhaa huru ulifanywa kwa kutumia thamani zilizoongezeka za nishati ya mgongano inayosababishwa na mgongano (CE). Kwa kifupi, kwanza changanua sampuli kwa kutumia ionization ya UHPLC-electrospray/qTOF-MS kwa kutumia hali ya spektrometri ya wingi mmoja (hali za kugawanyika chini zinazozalishwa na kugawanyika kwa chanzo), kuchanganua kutoka m/z 50 hadi 1500 kwa masafa ya marudio ya 5 Hz. Tumia nitrojeni kama gesi ya mgongano kwa ajili ya uchambuzi wa MS/MS, na ufanye vipimo huru katika volteji nne tofauti zifuatazo za kutengana zinazosababishwa na mgongano: 20, 30, 40, na 50 eV. Katika mchakato wote wa upimaji, quadrupole ina dirisha kubwa zaidi la kutenganisha uzito, kuanzia m/z 50 hadi 1500. Wakati jaribio la upana wa m/z na mwili wa mbele limewekwa kuwa 200, kiwango cha uzito huamilishwa kiotomatiki na programu ya uendeshaji ya kifaa na 0 Da. Changanua vipande vya uzito kama ilivyo katika hali ya uzito mmoja. Tumia sodiamu ya formate (50 ml isopropanol, 200 μl asidi fomi na 1 ml 1M NaOH myeyusho wa maji) kwa ajili ya urekebishaji wa uzito. Kwa kutumia algoriti ya urekebishaji wa usahihi wa hali ya juu ya Bruker, faili ya data hurekebishwa baada ya kuendesha wigo wa wastani katika kipindi fulani cha muda. Tumia kitendakazi cha usafirishaji cha programu ya Uchambuzi wa Data v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Ujerumani) ili kubadilisha faili ghafi za data kuwa umbizo la NetCDF. Seti ya data ya MS/MS imehifadhiwa katika hifadhidata iliyo wazi ya metabolomics MetaboLights (www.ebi.ac.uk) yenye nambari ya upatanishi. MTBLS1471.
Mkusanyiko wa MS/MS unaweza kutekelezwa kupitia uchanganuzi wa uwiano kati ya ishara za ubora wa MS1 na MS/MS kwa nishati ya chini na ya juu ya mgongano na sheria mpya zilizotekelezwa. Hati ya R hutumika kutambua uchanganuzi wa uwiano wa usambazaji wa kitangulizi kwa bidhaa, na hati ya C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) hutumika kutekeleza sheria.
Ili kupunguza makosa chanya ya uongo yanayosababishwa na kelele ya usuli na uwiano wa uongo unaosababishwa na kugundua vipengele fulani vya m/z katika sampuli chache tu, tunatumia kipengele cha "kilele kilichojazwa" cha kifurushi cha R. XCMS (kwa ajili ya urekebishaji wa kelele ya usuli). Kinapaswa kutumika kuchukua nafasi ya kiwango cha "NA" (kilele kisichoonekana). Wakati kipengele cha kilele cha kujaza kinatumika, bado kuna thamani nyingi za kiwango cha "0″ katika seti ya data ambazo zitaathiri hesabu ya uwiano. Kisha, tunalinganisha matokeo ya usindikaji wa data yaliyopatikana wakati kipengele cha kilele kilichojazwa kinatumika na wakati kipengele cha kilele kilichojazwa hakitumiki, na kuhesabu thamani ya kelele ya usuli kulingana na wastani wa thamani iliyokadiriwa iliyorekebishwa, na kisha kubadilisha thamani hizi za kiwango cha 0 na thamani ya usuli iliyohesabiwa. Pia tulizingatia vipengele ambavyo kiwango chake kilizidi mara tatu ya thamani ya usuli na kuviona kama "kilele cha kweli." Kwa hesabu za PCC, ni ishara za m/z pekee za mtangulizi wa sampuli (MS1) na seti za data za vipande zenye angalau vilele nane vya kweli ndizo zinazozingatiwa.
Ikiwa nguvu ya kipengele cha ubora wa kitangulizi katika sampuli nzima inahusiana kwa kiasi kikubwa na nguvu iliyopunguzwa ya kipengele kile kile cha ubora ambacho kinakabiliwa na nishati ya chini au ya juu ya mgongano, na kipengele hicho hakijaandikwa kama kilele cha isotopu na CAMERA, kinaweza kufafanuliwa zaidi. Kisha, kwa kuhesabu jozi zote zinazowezekana za kitangulizi-bidhaa ndani ya sekunde 3 (dirisha la muda unaokadiriwa wa uhifadhi kwa uhifadhi wa kilele), uchanganuzi wa uwiano unafanywa. Ni wakati tu thamani ya m/z iko chini kuliko thamani ya kitangulizi na mgawanyiko wa MS/MS unapotokea katika eneo moja la sampuli katika seti ya data kama kitangulizi ambacho kimetokana nacho, ndipo kinachukuliwa kuwa kipande.
Kulingana na sheria hizi mbili rahisi, tunatenga vipande vilivyoainishwa vyenye thamani ya m/z kubwa kuliko m/z ya kitangulizi kilichotambuliwa, na kulingana na nafasi ya sampuli ambapo kitangulizi kinaonekana na kipande kilichoainishwa. Inawezekana pia kuchagua vipengele vya ubora vinavyotokana na vipande vingi vya chanzo vilivyozalishwa katika hali ya MS1 kama vitangulizi vinavyohitajika, na hivyo kutoa misombo ya MS/MS isiyohitajika. Ili kupunguza upungufu huu wa data, ikiwa ufanano wa NDP wa spektra unazidi 0.6, na ni wa kromatogramu "pcgroup" iliyofafanuliwa na CAMERA, tutaviunganisha. Hatimaye, tunaunganisha matokeo yote manne ya CE yanayohusiana na kitangulizi na vipande kwenye wigo wa mwisho wa mchanganyiko ulioondolewa kwa kuchagua kilele cha kiwango cha juu zaidi kati ya vilele vyote vinavyohitajika vyenye thamani sawa ya m/z katika nishati tofauti za mgongano. Hatua zinazofuata za usindikaji zinategemea dhana ya wigo wa mchanganyiko na huzingatia hali tofauti za CE zinazohitajika ili kuongeza uwezekano wa kugawanyika, kwa sababu baadhi ya vipande vinaweza kugunduliwa tu chini ya nishati maalum ya mgongano.
RDPI (30) ilitumika kuhesabu uwezekano wa kushawishi wa wasifu wa kimetaboliki. Utofauti wa wigo wa kimetaboliki (kielezo cha Hj) unatokana na wingi wa vitangulizi vya MS/MS kwa kutumia entropi ya Shannon ya usambazaji wa masafa ya MS/MS kwa kutumia mlinganyo ufuatao ulioelezwa na Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) ambapo Pij inalingana na masafa ya jamaa ya i-th MS/MS katika sampuli ya j-th (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Umaalumu wa kimetaboliki (faharasa ya Si) hufafanuliwa kama utambulisho wa usemi wa MS/MS fulani kuhusiana na masafa kati ya sampuli zinazozingatiwa. Umaalumu wa MS/MS huhesabiwa kama Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Tumia fomula ifuatayo kupima faharisi ya δj maalum ya metabolomu ya kila sampuli ya j, na wastani wa umaalumu wa MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Spektra za MS/MS zimepangwa katika jozi, na kufanana huhesabiwa kulingana na alama hizo mbili. Kwanza, kwa kutumia NDP ya kawaida (pia inajulikana kama mbinu ya uunganisho wa kosine), tumia mlinganyo ufuatao kupata alama ya kufanana kwa sehemu kati ya spktra NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 ambapo S1 na S2 Vivyo hivyo, kwa spktra 1 na spktra 2, pamoja na WS1, i na WS2, i inawakilisha uzito kulingana na kiwango cha kilele kwamba tofauti ya kilele cha kawaida cha i-th kati ya spktra hizo mbili ni chini ya 0.01 Da. Uzito huhesabiwa kama ifuatavyo: W = [kiwango cha kilele] m [ubora] n, m = 0.5, n = 2, kama ilivyopendekezwa na MassBank.
Mbinu ya pili ya upimaji ilitekelezwa, ambayo ilihusisha kuchanganua NL iliyoshirikiwa kati ya MS/MS. Kwa lengo hili, tulitumia orodha 52 za ​​NL zinazopatikana mara kwa mara wakati wa mchakato wa kugawanyika kwa MS sanjari, na NL maalum zaidi (faili la data S1) ambayo imefafanuliwa hapo awali kwa wigo wa MS/MS wa metaboliti za sekondari za spishi dhaifu za Nepenthes (9, 26). Unda vekta ya binary ya 1 na 0 kwa kila MS/MS, inayolingana na mkondo na kutokuwepo kwa baadhi ya NL mtawalia. Kulingana na kufanana kwa umbali wa Euclidean, alama ya kufanana ya NL huhesabiwa kwa kila jozi ya vekta za binary NL.
Ili kufanya makundi mawili, tulitumia kifurushi cha R DiffCoEx, ambacho kinategemea ugani wa Uchambuzi wa Ulinganisho wa Jeni Weighted (WGCNA). Kwa kutumia matrices ya alama za NDP na NL za spektra za MS/MS, tulitumia DiffCoEx kukokotoa matrix ya uwiano linganishi. Makundi ya binary hufanywa kwa kuweka kigezo cha "cutreeDynamic" kuwa mbinu = "mseto", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, na minClusterSize = 10. Msimbo chanzo wa R wa DiffCoEx ulipakuliwa kutoka kwa faili ya ziada 1 na Tesson et al. (57); Kifurushi cha programu cha R WGCNA kinachohitajika kinaweza kupatikana katika https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Ili kufanya uchanganuzi wa mtandao wa molekuli wa MS/MS, tulihesabu muunganisho wa spektrali uliooanishwa kulingana na aina za kufanana za NDP na NL, na tulitumia programu ya Cytoscape kuibua topolojia ya mtandao kwa kutumia mpangilio wa kikaboni katika programu ya kiendelezi cha algoriti ya mpangilio wa CyFilescape yFiles.
Tumia toleo la R 3.0.1 kufanya uchambuzi wa takwimu kwenye data. Umuhimu wa takwimu ulipimwa kwa kutumia uchambuzi wa njia mbili wa tofauti (ANOVA), ikifuatiwa na jaribio la baada ya hoc la Tukey la tofauti kubwa (HSD). Ili kuchambua tofauti kati ya matibabu ya mimea na udhibiti, usambazaji wa mikia miwili wa makundi mawili ya sampuli zenye tofauti sawa ulichambuliwa kwa kutumia jaribio la t la Mwanafunzi.
Kwa nyenzo za ziada kwa makala haya, tafadhali tazama http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Hii ni makala ya ufikiaji wazi inayosambazwa chini ya masharti ya Leseni ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, ambayo inaruhusu matumizi, usambazaji na uzandikishaji katika njia yoyote, mradi tu matumizi ya mwisho si kwa faida ya kibiashara na msingi ni kwamba kazi ya awali ni sahihi. Marejeleo.
Kumbuka: Tunakuomba tu utoe anwani yako ya barua pepe ili mtu unayempendekeza kwenye ukurasa ajue kwamba unataka aone barua pepe hiyo na kwamba si barua taka. Hatutarekodi anwani zozote za barua pepe.
Swali hili linatumika kujaribu kama wewe ni mgeni na kuzuia uwasilishaji wa barua taka kiotomatiki.
Nadharia ya habari hutoa sarafu ya jumla kwa ajili ya kulinganisha metabolomu maalum na utabiri wa nadharia za utetezi wa majaribio.
Nadharia ya habari hutoa sarafu ya jumla kwa ajili ya kulinganisha metabolomu maalum na utabiri wa nadharia za utetezi wa majaribio.
©2021 Chama cha Marekani cha Kuendeleza Sayansi. haki zote zimehifadhiwa. AAAS ni mshirika wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef na COUNTER. SayansiMaendeleo ISSN 2375-2548.