Makala hii ni sehemu ya mada ya utafiti "Kuboresha upinzani wa kunde dhidi ya vimelea na wadudu", tazama makala zote 5
Wakala wa kisababishi cha necrosis ya ugonjwa wa kuvu wa mimea Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary hutumia mkakati wa ngazi nyingi kuambukiza mimea mwenyeji tofauti. Utafiti huu unapendekeza matumizi ya diamine L-ornithine, asidi amino isiyo ya protini ambayo huchochea usanisi wa amino asidi nyingine muhimu, kama mkakati mbadala wa usimamizi ili kuongeza majibu ya molekuli, kisaikolojia na kibiokemikali ya Phaseolus vulgaris L. kwa ukungu mweupe unaosababishwa na Pseudomonas sclerotiorum. Majaribio ya ndani ya vitro yalionyesha kuwa L-ornithine ilizuia kwa kiasi kikubwa ukuaji wa mycelial wa S. pyrenoidosa kwa njia inayotegemea kipimo. Zaidi ya hayo, inaweza kupunguza kwa kiasi kikubwa ukali wa ukungu mweupe chini ya hali ya chafu. Zaidi ya hayo, L-ornithine ilichochea ukuaji wa mimea iliyotibiwa, ikionyesha kwamba viwango vilivyojaribiwa vya L-ornithine havikuwa sumu ya mimea iliyotibiwa. Kwa kuongezea, L-ornithine iliongeza usemi wa vioksidishaji visivyo vya kimeng'enya (fenoliki na flavonoids mumunyifu) na vioksidishaji vya kimeng'enya (catalase (CAT), peroxidase (POX), na poliphenol oxidase (PPO)), na kuongeza usemi wa jeni tatu zinazohusiana na antioxidant (PvCAT1, PvSOD, na PvGR). Zaidi ya hayo, katika uchanganuzi wa siliko ulionyesha uwepo wa protini ya oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) inayoweza kudhaniwa katika jenomu ya S. sclerotiorum, ambayo ilikuwa sawa sana na protini za oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) za Aspergillus fijiensis (AfOAH) na Penicillium sp. (PlOAH) katika suala la uchanganuzi wa utendaji, maeneo yaliyohifadhiwa, na topolojia. Cha kufurahisha ni kwamba, kuongezwa kwa L-ornithine kwenye kitoweo cha dextrose ya viazi (PDB) kulipunguza kwa kiasi kikubwa usemi wa jeni la SsOAH katika mycelia ya S. sclerotiorum. Vile vile, matumizi ya nje ya L-ornithine yalipunguza kwa kiasi kikubwa usemi wa jeni la SsOAH katika mycelia ya kuvu iliyokusanywa kutoka kwa mimea iliyotibiwa. Hatimaye, matumizi ya L-ornithine yalipunguza kwa kiasi kikubwa utolewaji wa asidi ya oxaliki katika majani ya kati ya PDB na yaliyoambukizwa. Kwa kumalizia, L-ornithine ina jukumu muhimu katika kudumisha hali ya redoksi pamoja na kuongeza mwitikio wa ulinzi wa mimea iliyoambukizwa. Matokeo ya utafiti huu yanaweza kusaidia katika kutengeneza mbinu bunifu na rafiki kwa mazingira ili kudhibiti ukungu mweupe na kupunguza athari zake kwenye uzalishaji wa maharagwe na mazao mengine.
Ukungu mweupe, unaosababishwa na kuvu wa necrotrophic Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ni ugonjwa mbaya na unaopunguza mavuno ambao ni tishio kubwa kwa uzalishaji wa maharagwe duniani (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum ni mojawapo ya vimelea vigumu zaidi vya mimea ya kuvu inayoenezwa na udongo kudhibiti, ikiwa na aina mbalimbali za mimea zaidi ya 600 na uwezo wa kung'oa tishu za mwenyeji kwa haraka kwa njia isiyo maalum (Liang na Rollins, 2018). Chini ya hali mbaya, hupitia awamu muhimu ya mzunguko wake wa maisha, ikibaki ikiwa imelala kwa muda mrefu kama miundo nyeusi, ngumu, kama mbegu inayoitwa 'sclerotia' kwenye udongo au kama ukuaji mweupe, laini kwenye mycelium au shina la mimea iliyoambukizwa (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum ina uwezo wa kutengeneza sclerotia, ambayo inaruhusu kuishi katika mashamba yaliyoambukizwa kwa muda mrefu na kuendelea wakati wa ugonjwa (Schwartz et al., 2005). Sclerotia ina virutubisho vingi, inaweza kudumu kwenye udongo kwa muda mrefu, na hutumika kama chanjo ya msingi kwa maambukizi yanayofuata (Schwartz et al., 2005). Katika hali nzuri, sclerotia huota na kutoa spores zinazopeperushwa hewani ambazo zinaweza kuambukiza sehemu zote za juu ya ardhi za mmea, ikiwa ni pamoja na lakini sio tu maua, mashina, au maganda (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum hutumia mkakati wa ngazi nyingi kuambukiza mimea mwenyeji wake, unaohusisha mfululizo wa matukio yaliyoratibiwa kuanzia kuota kwa sclerotial hadi ukuaji wa dalili. Hapo awali, S. sclerotiorum hutoa spores zilizosimamishwa (zinazoitwa ascospores) kutoka kwa miundo kama uyoga inayoitwa apothecia, ambayo hupeperushwa hewani na kukua na kuwa sclerotia isiyosogea kwenye mabaki ya mimea iliyoambukizwa (Bolton et al., 2006). Kisha kuvu hutoa asidi ya oxalic, kipengele cha virulence, ili kudhibiti pH ya ukuta wa seli za mimea, kukuza uharibifu wa kimeng'enya na uvamizi wa tishu (Hegedus na Rimmer, 2005), na kukandamiza mlipuko wa oksidi wa mmea mwenyeji. Mchakato huu wa asidi hudhoofisha ukuta wa seli za mimea, na kutoa mazingira mazuri kwa ajili ya uendeshaji wa kawaida na ufanisi wa vimeng'enya vinavyoharibu ukuta wa seli za kuvu (CWDEs), kuruhusu pathogen kushinda kizuizi cha kimwili na kupenya tishu za mwenyeji (Marciano et al., 1983). Mara tu inapopenya, S. sclerotiorum hutoa idadi ya CWDE, kama vile polygalacturonase na selulosi, ambayo hurahisisha usambazaji wake katika tishu zilizoambukizwa na kusababisha necrosis ya tishu. Kuendelea kwa vidonda na mikeka ya hyphal husababisha dalili za tabia za ukungu mweupe (Hegedus na Rimmer, 2005). Wakati huo huo, mimea mwenyeji hutambua mifumo ya molekuli inayohusiana na vimelea (PAMPs) kupitia vipokezi vya utambuzi wa muundo (PRRs), na kusababisha mfululizo wa matukio ya kuashiria ambayo hatimaye huamsha majibu ya ulinzi.
Licha ya miongo kadhaa ya juhudi za kudhibiti magonjwa, uhaba wa vijidudu sugu vya kutosha unabaki kwenye maharagwe, kama ilivyo katika mazao mengine ya kibiashara, kutokana na upinzani, uhai, na kubadilika kwa vijidudu hivyo. Kwa hivyo, usimamizi wa magonjwa ni changamoto kubwa na unahitaji mkakati jumuishi na wenye vipengele vingi unaojumuisha mchanganyiko wa desturi za kitamaduni, udhibiti wa kibiolojia, na dawa za kuua kuvu za kemikali (O'Sullivan et al., 2021). Udhibiti wa kemikali wa ukungu mweupe ndio unaofaa zaidi kwa sababu dawa za kuua kuvu, zinapotumika kwa usahihi na kwa wakati unaofaa, zinaweza kudhibiti kuenea kwa ugonjwa huo kwa ufanisi, kupunguza ukali wa maambukizi, na kupunguza hasara za mavuno. Hata hivyo, matumizi kupita kiasi na kutegemea kupita kiasi dawa za kuua kuvu kunaweza kusababisha kuibuka kwa aina sugu za S. sclerotiorum na kuathiri vibaya viumbe visivyolengwa, afya ya udongo, na ubora wa maji (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Kwa hivyo, kutafuta njia mbadala rafiki kwa mazingira kumekuwa kipaumbele cha juu.
Polyamini (PA), kama vile putrescine, spermidine, spermine, na cadaverine, zinaweza kutumika kama njia mbadala zenye matumaini dhidi ya vimelea vya mimea vinavyoenezwa na udongo, na hivyo kupunguza kabisa au kwa kiasi matumizi ya dawa hatari za kuvu za kemikali (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Katika mimea ya juu, PA zinahusika katika michakato mingi ya kisaikolojia ikiwa ni pamoja na, lakini sio tu, mgawanyiko wa seli, utofautishaji, na mwitikio wa mikazo ya abiotic na biotic (Killiny na Nehela, 2020). Zinaweza kufanya kazi kama vioksidishaji, kusaidia kuchuja spishi tendaji za oksijeni (ROS), kudumisha homeostasis ya redoksi (Nehela na Killiny, 2023), kuchochea jeni zinazohusiana na ulinzi (Romero et al., 2018), kudhibiti njia mbalimbali za kimetaboliki (Nehela na Killiny, 2023), kurekebisha homoni za phytohomoni za ndani (Nehela na Killiny, 2019), kuanzisha upinzani unaopatikana kimfumo (SAR), na kudhibiti mwingiliano wa mimea na vimelea (Nehela na Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Inafaa kuzingatia kwamba mifumo na majukumu maalum ya PA katika ulinzi wa mimea hutofautiana kulingana na spishi za mimea, vimelea vya magonjwa, na hali ya mazingira. PA iliyopo zaidi katika mimea imesanisiwa kibiolojia kutoka kwa poliamine L-ornithine muhimu (Killiny na Nehela, 2020).
L-ornithine ina majukumu mengi katika ukuaji na ukuaji wa mimea. Kwa mfano, tafiti za awali zimeonyesha kuwa katika mchele (Oryza sativa), ornithine inaweza kuhusishwa na urejelezaji wa nitrojeni (Liu et al., 2018), mavuno ya mchele, ubora na harufu (Lu et al., 2020), na mwitikio wa msongo wa maji (Yang et al., 2000). Zaidi ya hayo, matumizi ya nje ya L-ornithine yaliongeza kwa kiasi kikubwa uvumilivu wa ukame katika beetroot ya sukari (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) na kupunguza msongo wa chumvi katika kitunguu (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu na Çavuşoǧlu, 2021) na mimea ya korosho (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Jukumu linalowezekana la L-ornithine katika ulinzi wa msongo wa abiotic linaweza kuwa kutokana na kuhusika kwake katika mkusanyiko wa proline katika mimea iliyotibiwa. Kwa mfano, jeni zinazohusiana na metaboli ya proline, kama vile jeni za ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) na proline dehydrogenase (ProDH1 na ProDH2), zimeripotiwa hapo awali kuhusika katika ulinzi wa Nicotiana benthamiana na Arabidopsis thaliana dhidi ya aina zisizo za Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar na Mysore, 2012). Kwa upande mwingine, fangasi ornithine decarboxylase (ODC) inahitajika kwa ukuaji wa vimelea (Singh et al., 2020). Kulenga ODC ya Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici kupitia kunyamazisha jeni linalosababishwa na mwenyeji (HIGS) kuliongeza kwa kiasi kikubwa upinzani wa mimea ya nyanya dhidi ya Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Hata hivyo, jukumu linalowezekana la matumizi ya ornithine ya nje dhidi ya mikazo ya kibiolojia kama vile phytopathogens halijasomwa vizuri. Muhimu zaidi, athari za ornithine kwenye upinzani wa magonjwa na matukio yanayohusiana ya kibiokemikali na kisaikolojia bado hayajachunguzwa kwa kiasi kikubwa.
Kuelewa ugumu wa maambukizi ya S. sclerotiorum ya mikunde ni muhimu kwa ajili ya maendeleo ya mikakati madhubuti ya udhibiti. Katika utafiti huu, tulilenga kutambua jukumu linalowezekana la diamine L-ornithine kama jambo muhimu katika kuongeza mifumo ya ulinzi na upinzani wa mimea ya mikunde dhidi ya maambukizi ya Sclerotinia sclerotiorum. Tunakisia kwamba, pamoja na kuongeza majibu ya ulinzi wa mimea iliyoambukizwa, L-ornithine pia ina jukumu muhimu katika kudumisha hali ya redoksi. Tunapendekeza kwamba athari zinazowezekana za L-ornithine zinahusiana na udhibiti wa mifumo ya ulinzi wa antioxidant ya kimeng'enya na isiyo ya kimeng'enya na kuingilia kati kwa sababu za pathogenicity/virulence ya kuvu na protini zinazohusiana. Utendaji huu maradufu wa L-ornithine unaifanya kuwa mgombea anayeahidi kwa mkakati endelevu wa kupunguza athari za ukungu mweupe na kuongeza upinzani wa mazao ya kawaida ya mikunde dhidi ya pathojeni hii yenye nguvu ya ukungu. Matokeo ya utafiti huu yanaweza kusaidia katika maendeleo ya mbinu bunifu na rafiki kwa mazingira ili kudhibiti ukungu mweupe na kupunguza athari zake kwenye uzalishaji wa mikunde.
Katika utafiti huu, aina ya maharagwe ya kawaida yanayoweza kuathiriwa kibiashara, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), ilitumika kama nyenzo ya majaribio. Mbegu zenye afya zilitolewa kwa hisani na Idara ya Utafiti wa Mikunde, Taasisi ya Utafiti wa Mazao ya Mashambani (FCRI), Kituo cha Utafiti wa Kilimo (ARC), Misri. Mbegu tano zilipandwa kwenye vyungu vya plastiki (kipenyo cha ndani 35 cm, kina 50 cm) vilivyojazwa udongo ulioambukizwa na S. sclerotiorum chini ya hali ya chafu (25 ± 2 °C, unyevunyevu 75 ± 1%, saa 8 mwanga/saa 16 giza). Siku 7-10 baada ya kupanda (DPS), miche ilipunguzwa ili kuacha miche miwili tu yenye ukuaji sawa na majani matatu yaliyopanuka kikamilifu katika kila vyungu. Mimea yote iliyo kwenye vyungu ilimwagiliwa maji mara moja kila baada ya wiki mbili na kupewa mbolea kila mwezi kwa kiwango kilichopendekezwa kwa aina iliyotolewa.
Ili kuandaa mkusanyiko wa 500 mg/L wa L-ornithinediamine (pia inajulikana kama (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Ujerumani), 50 mg iliyeyushwa kwanza katika 100 mL ya maji tasa yaliyosafishwa. Myeyusho wa hisa kisha ulipunguzwa na kutumika katika majaribio yaliyofuata. Kwa kifupi, mfululizo sita wa viwango vya L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, na 125 mg/L) vilijaribiwa ndani ya maabara. Zaidi ya hayo, maji tasa yaliyosafishwa yalitumika kama udhibiti hasi (Mock) na dawa ya kuvu ya kibiashara "Rizolex-T" 50% poda ya kulowesha (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Kampuni ya Viuatilifu na Kemikali, Kafr El Zayat, Gavana wa Gharbia, Misri) ilitumika kama udhibiti chanya. Dawa ya kuvu ya kibiashara "Rizolex-T" ilijaribiwa ndani ya vitro katika viwango vitano (2, 4, 6, 8 na 10 mg/L).
Sampuli za mashina na maganda ya maharagwe ya kawaida yanayoonyesha dalili za kawaida za ukungu mweupe (kiwango cha maambukizi: 10–30%) zilikusanywa kutoka mashamba ya biashara. Ingawa mimea mingi iliyoambukizwa ilitambuliwa kwa aina/aina (aina ya kibiashara inayoweza kuathiriwa na Giza 3), mingine, hasa ile iliyopatikana kutoka masoko ya ndani, ilikuwa ya aina isiyojulikana. Nyenzo zilizokusanywa zilizoambukizwa zilisafishwa kwanza kwa uso kwa suluhisho la 0.5% ya sodiamu hipokloriti kwa dakika 3, kisha zikaoshwa mara kadhaa kwa maji safi yaliyosafishwa na kufutwa kwa karatasi ya chujio safi ili kuondoa maji ya ziada. Viungo vilivyoambukizwa vilikatwa vipande vidogo kutoka kwa tishu ya kati (kati ya tishu zenye afya na zilizoambukizwa), vilipandwa kwenye sehemu ya kati ya dextrose agar ya viazi (PDA) na kuwekwa kwenye incubator kwa joto la 25 ± 2 °C kwa mzunguko wa giza wa saa 12/saa 12 kwa siku 5 ili kuchochea uundaji wa sclerotia. Njia ya ncha ya mycelial pia ilitumika kusafisha vijidudu vya kuvu kutoka kwa tamaduni mchanganyiko au zilizochafuliwa. Kiini cha kuvu kilichosafishwa kilitambuliwa kwanza kulingana na sifa zake za kimofolojia za kitamaduni na kisha kikathibitishwa kuwa S. sclerotiorum kulingana na sifa za hadubini. Hatimaye, viini vyote vilivyosafishwa vilijaribiwa kwa ajili ya kubaini vimelea kwenye aina ya maharagwe ya kawaida yanayoweza kuathiriwa ya Giza 3 ili kukidhi viini vya Koch.
Kwa kuongezea, S. sclerotiorum isolate vamizi zaidi (isolate #3) ilithibitishwa zaidi kulingana na mpangilio wa ndani wa spacer iliyoandikwa (ITS) kama ilivyoelezwa na White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Kwa kifupi, isolates zilikuzwa katika mchuzi wa dextrose ya viazi (PDB) na kuanguliwa kwa joto la 25 ± 2 °C kwa siku 5-7. Mycelium ya kuvu kisha ilikusanywa, kuchujwa kupitia kitambaa cha cheesecloth, kuoshwa mara mbili kwa maji safi, na kukaushwa kwa karatasi ya kuchuja safi. DNA ya jenomu ilitengwa kwa kutumia Kifaa cha Kutayarisha Viungo cha Kuvu/Bakteria cha Quick-DNA™ (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Eneo la ITS rDNA liliongezwa kwa kutumia jozi maalum ya primer ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGGCG TCCTCGCTTTATTGATATGC; ukubwa unaotarajiwa: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Bidhaa za PCR zilizosafishwa ziliwasilishwa kwa ajili ya mpangilio (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Mfuatano wa ITS rDNA ulipangwa pande mbili kwa kutumia mbinu ya mpangilio wa Sanger. Mfuatano wa hoja zilizokusanywa ulilinganishwa na data ya hivi karibuni katika GenBank na Kituo cha Kitaifa cha Habari za Bioteknolojia (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) kwa kutumia programu ya BLASTn. Mfuatano wa hoja ulilinganishwa na aina/vijitenga vingine 20 vya S. sclerotiorum vilivyopatikana kutoka kwa data ya hivi karibuni katika NCBI GenBank (Jedwali la Nyongeza S1) kwa kutumia ClustalW katika Kifurushi cha Uchambuzi wa Jenetiki ya Mageuzi ya Masi (MEGA-11; toleo la 11) (Kumar et al., 2024). Uchambuzi wa mageuzi ulifanywa kwa kutumia mbinu ya uwezekano wa juu zaidi na modeli ya jumla ya ubadilishaji wa nyukleotidi inayoweza kubadilishwa wakati (Nei na Kumar, 2000). Mti wenye uwezekano wa juu zaidi wa logi umeonyeshwa. Mti wa awali wa utafutaji wa heuristic huchaguliwa kwa kuchagua mti wenye uwezekano wa juu zaidi wa logi kati ya mti unaoungana na jirani (NJ) (Kumar et al., 2024) na mti wa juu zaidi wa parsimony (MP). Mti wa NJ ulijengwa kwa kutumia matrix ya umbali wa pande mbili iliyohesabiwa kwa kutumia modeli ya jumla inayoweza kubadilishwa wakati (Nei na Kumar, 2000).
Shughuli ya bakteria ya L-ornithine na dawa ya bakteria "Rizolex-T" ilibainishwa ndani ya vitro kwa kutumia mbinu ya uenezaji wa agar. Mbinu: Chukua kiasi kinachofaa cha mchanganyiko wa L-ornithine (500 mg/L) na uchanganye vizuri na 10 ml ya mchanganyiko wa virutubisho wa PDA ili kuandaa myeyusho yenye viwango vya mwisho vya 12.5, 25, 50, 75, 100 na 125 mg/L, mtawalia. Viwango vitano vya dawa ya kuua kuvu "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 na 10 mg/L) na maji tasa yaliyosafishwa vilitumika kama udhibiti. Baada ya mchanganyiko huo kuganda, kizibo kipya cha mycelial cha utamaduni wa Sclerotinia sclerotiorum, chenye kipenyo cha 4 mm, kilihamishiwa katikati ya mchanganyiko wa Petri na kukuzwa kwa joto la 25±2°C hadi mchanganyiko wa mycelium ufunike mchanganyiko mzima wa mchanganyiko wa Petri, baada ya hapo ukuaji wa kuvu ulirekodiwa. Hesabu asilimia ya kizuizi cha ukuaji wa radial wa S. sclerotiorum kwa kutumia mlinganyo wa 1:
Jaribio lilirudiwa mara mbili, huku nakala sita za kibiolojia kwa kila kundi la udhibiti/majaribio na vyungu vitano (mimea miwili kwa kila vyungu) kwa kila nakala ya kibiolojia. Kila nakala ya kibiolojia ilichambuliwa mara mbili (nakala mbili za kiufundi) ili kuhakikisha usahihi, uaminifu na urejeleaji wa matokeo ya majaribio. Zaidi ya hayo, uchambuzi wa urejeleaji wa probit ulitumika kuhesabu mkusanyiko wa kizuizi cha nusu-upeo (IC50) na IC99 (Prentice, 1976).
Ili kutathmini uwezo wa L-ornithine chini ya hali ya chafu, majaribio mawili mfululizo ya vyungu yalifanyika. Kwa kifupi, vyungu vilijazwa udongo wa mchanga wa udongo uliosafishwa (3:1) na kuchanjwa kwa kutumia mmea mpya wa S. sclerotiorum. Kwanza, sehemu vamizi zaidi ya S. sclerotiorum (isolate #3) ilikuzwa kwa kukata sclerotium moja katikati, ikiiweka inakabiliwa chini kwenye PDA na kuanguliwa kwa 25°C katika giza lisilobadilika (saa 24) kwa siku 4 ili kuchochea ukuaji wa mycelial. Viziba vinne vya agar vyenye kipenyo cha mm 5 vilichukuliwa kutoka ukingo wa mbele na kuchanjwa kwa 100 g ya mchanganyiko tasa wa ngano na pumba za mchele (1:1, v/v) na vyungu vyote vilianguliwa kwa 25 ± 2 °C chini ya mzunguko wa giza wa saa 12/saa 12 kwa siku 5 ili kuchochea uundaji wa sclerotia. Yaliyomo kwenye vyungu vyote yalichanganywa vizuri ili kuhakikisha usawa kabla ya kuongeza udongo. Kisha, gramu 100 za mchanganyiko wa pumba zilizozalishwa ziliongezwa kwenye kila sufuria ili kuhakikisha mkusanyiko wa vimelea vya magonjwa unaoendelea. Vyungu vilivyochanjwa vilimwagiliwa maji ili kuamsha ukuaji wa kuvu na kuwekwa kwenye hali ya chafu kwa siku 7.
Mbegu tano za aina ya Giza 3 zilipandwa katika kila sufuria. Kwa vyungu vilivyotibiwa na L-ornithine na dawa ya kuvu ya Rizolex-T, mbegu zilizosafishwa zililowekwa kwanza kwa saa mbili katika mmumunyo wa maji wa misombo hiyo miwili yenye mkusanyiko wa mwisho wa IC99 wa takriban 250 mg/L na 50 mg/L, mtawalia, na kisha kukaushwa kwa hewa kwa saa moja kabla ya kupanda. Kwa upande mwingine, mbegu zililowekwa kwenye maji tasa yaliyosafishwa kama udhibiti hasi. Baada ya siku 10, kabla ya kumwagilia kwa mara ya kwanza, miche ilipunguzwa, na kuacha miche miwili tu safi katika kila sufuria. Zaidi ya hayo, ili kuhakikisha maambukizi ya S. sclerotiorum, mashina ya mimea ya maharagwe katika hatua sawa ya ukuaji (siku 10) yalikatwa katika maeneo mawili tofauti kwa kutumia kisu kilichosafishwa na takriban 0.5 g ya mchanganyiko wa matawi yaliyowekwa kwenye kila jeraha, ikifuatiwa na unyevunyevu mwingi ili kuchochea maambukizi na ukuaji wa magonjwa katika mimea yote iliyochanjwa. Mimea ya kudhibiti ilijeruhiwa vivyo hivyo na kiasi sawa (0.5 g) cha mchanganyiko wa pumba tasa, ambao haujatawanywa na koloni kiliwekwa kwenye jeraha na kutunzwa chini ya unyevu mwingi ili kuiga mazingira ya ukuaji wa ugonjwa na kuhakikisha uthabiti kati ya vikundi vya matibabu.
Njia ya Matibabu: Miche ya maharagwe ilimwagiliwa maji kwa mililita 500 za mmumunyo wa maji wa L-ornithine (250 mg/l) au dawa ya kuvu ya Rizolex-T (50 mg/l) kwa kumwagilia udongo, kisha matibabu hayo yalirudiwa mara tatu kwa muda wa siku 10. Vidhibiti vilivyotibiwa kwa placebo vilimwagiliwa maji kwa mililita 500 za maji safi yaliyosafishwa. Matibabu yote yalifanywa chini ya hali ya hewa ya chafu (25 ± 2°C, unyevu wa 75 ± 1%, na kipindi cha mwanga wa saa 8/saa 16 giza). Vyungu vyote vilimwagiliwa maji kila baada ya wiki mbili na kutibiwa kila mwezi kwa mbolea ya NPK iliyosawazishwa (20-20-20, na 3.6% ya salfa na vipengele vidogo vya TE; Zain Seeds, Misri) kwa mkusanyiko wa 3–4 g/l kwa kunyunyizia majani kulingana na mapendekezo ya aina maalum na maagizo ya mtengenezaji. Isipokuwa kama imeelezwa vinginevyo, majani yaliyokomaa yaliyopanuka kikamilifu (jani la 2 na la 3 kutoka juu) yalikusanywa kutoka kwa kila nakala ya kibiolojia baada ya saa 72 baada ya matibabu (hpt), yalibadilishwa kuwa homogeneous, yalikusanywa pamoja na kuhifadhiwa kwenye -80 °C kwa ajili ya uchambuzi zaidi ikiwa ni pamoja na, lakini sio tu, ujanibishaji wa histokemikali wa viashiria vya msongo wa oksidi katika hali halisi, peroxidation ya lipid, vioksidishaji vya kimeng'enya na visivyo vya kimeng'enya na usemi wa jeni.
Kiwango cha maambukizi ya ukungu mweupe kilipimwa kila wiki siku 21 baada ya chanjo (dpi) kwa kutumia kipimo cha 1–9 (Jedwali la Nyongeza S2) kulingana na kipimo cha Petzoldt na Dickson (1996) kilichorekebishwa na Teran et al. (2006). Kwa kifupi, mashina na matawi ya mimea ya maharagwe yalichunguzwa kuanzia hatua ya chanjo ili kufuata mwendelezo wa vidonda kando ya nodi na vifundo. Umbali wa kidonda kutoka sehemu ya chanjo hadi sehemu ya mbali zaidi kando ya shina au tawi ulipimwa na alama ya 1–9 ilitolewa kulingana na eneo la kidonda, ambapo (1) ilionyesha hakuna maambukizi yanayoonekana karibu na sehemu ya chanjo na (2–9) ilionyesha ongezeko la taratibu la ukubwa wa kidonda na mwendelezo kando ya nodi/vifundo (Jedwali la Nyongeza S2). Kiwango cha maambukizi ya ukungu mweupe kilibadilishwa kuwa asilimia kwa kutumia fomula ya 2:
Zaidi ya hayo, eneo lililo chini ya mkondo wa kuendelea kwa ugonjwa (AUDPC) lilihesabiwa kwa kutumia fomula (Shaner na Finney, 1977), ambayo hivi karibuni ilibadilishwa kwa ajili ya kuoza nyeupe kwa maharagwe ya kawaida (Chauhan et al., 2020) kwa kutumia mlinganyo wa 3:
Ambapo Yi = ukali wa ugonjwa kwa wakati ti, Yi+1 = ukali wa ugonjwa kwa wakati unaofuata ti+1, ti = wakati wa kipimo cha kwanza (kwa siku), ti+1 = wakati wa kipimo kinachofuata (kwa siku), n = jumla ya idadi ya pointi za muda au pointi za uchunguzi. Vigezo vya ukuaji wa mimea ya maharagwe ikijumuisha urefu wa mmea (cm), idadi ya matawi kwa kila mmea, na idadi ya majani kwa kila mmea vilirekodiwa kila wiki kwa siku 21 katika nakala zote za kibiolojia.
Katika kila nakala ya kibiolojia, sampuli za majani (majani ya pili na ya tatu yaliyokua kikamilifu kutoka juu) zilikusanywa siku ya 45 baada ya matibabu (siku 15 baada ya matibabu ya mwisho). Kila nakala ya kibiolojia ilihusisha vyungu vitano (mimea miwili kwa kila vyungu). Takriban miligramu 500 za tishu zilizosagwa zilitumika kwa ajili ya kutoa rangi za usanisinuru (klorofili a, klorofili b na karotenoidi) kwa kutumia asetoni 80% kwa 4 °C gizani. Baada ya saa 24, sampuli ziliwekwa kwenye sentrifuge na supernatant ilikusanywa kwa ajili ya kubaini yaliyomo klorofili a, klorofili b na karotenoidi kwa kutumia spectrophotometer ya UV-160A (Shimadzu Corporation, Japani) kulingana na mbinu ya (Lichtenthaler, 1987) kwa kupima unyonyaji katika mawimbi matatu tofauti (A470, A646 na A663 nm). Hatimaye, kiwango cha rangi za usanisinuru kilihesabiwa kwa kutumia fomula zifuatazo 4–6 zilizoelezwa na Lichtenthaler (1987).
Baada ya saa 72 baada ya matibabu (hpt), majani (ya pili na ya tatu yaliyokua kikamilifu kutoka juu) yalikusanywa kutoka kwa kila nakala ya kibiolojia kwa ajili ya ujanibishaji wa histokemikali wa peroksidi ya hidrojeni (H2O2) na anioni ya superoxide (O2•−). Kila nakala ya kibiolojia ilihusisha vyungu vitano (mimea miwili kwa kila vyungu). Kila nakala ya kibiolojia ilichambuliwa kwa nakala mbili (nakala mbili za kiufundi) ili kuhakikisha usahihi, uaminifu na uzazi wa mbinu hiyo. H2O2 na O2•− ziliamuliwa kwa kutumia 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Ujerumani) au tetrazolium ya nitroblue (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Ujerumani), mtawalia, kufuatia mbinu zilizoelezwa na Romero-Puertas et al. (2004) na Adam et al. (1989) pamoja na marekebisho madogo. Kwa ujanibishaji wa histokemikali wa H2O2 katika eneo, vipeperushi viliingizwa kwa utupu na 0.1% DAB katika 10 mM Tris buffer (pH 7.8) na kisha kuwekwa kwenye halijoto ya kawaida katika mwanga kwa dakika 60. Vipeperushi vilipauka katika 0.15% (v/v) TCA katika 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) na kisha kuwekwa kwenye mwanga hadi viwe giza. Vile vile, vali ziliingizwa kwa utupu na 10 mM potasiamu fosfeti buffer (pH 7.8) yenye 0.1 w/v % HBT kwa ujanibishaji wa histokemikali wa O2•− katika eneo. Vipeperushi viliwekwa kwenye halijoto ya kawaida kwa dakika 20, kisha vikawekwa kama ilivyo hapo juu, na kisha kuangazwa hadi madoa meusi ya bluu/violet yatokee. Ukali wa rangi ya kahawia inayotokana (kama kiashiria cha H2O2) au bluu-zambarau (kama kiashiria cha O2•−) ilipimwa kwa kutumia toleo la Fiji la kifurushi cha usindikaji wa picha ImageJ (http://fiji.sc; ilifikiwa Machi 7, 2024).
Malondialdehyde (MDA; kama alama ya peroxidation ya lipid) ilibainishwa kulingana na mbinu ya Du na Bramlage (1992) kwa marekebisho madogo. Majani kutoka kwa kila nakala ya kibiolojia (majani ya pili na ya tatu yaliyokua kikamilifu kutoka juu) yalikusanywa baada ya saa 72 baada ya matibabu (hpt). Kila nakala ya kibiolojia ilijumuisha vyungu vitano (mimea miwili kwa kila vyungu). Kila nakala ya kibiolojia ilichambuliwa kwa nakala mbili (nakala mbili za kiufundi) ili kuhakikisha usahihi, uaminifu na uzazi wa mbinu hiyo. Kwa kifupi, 0.5 g ya tishu za majani ya ardhini ilitumika kwa uchimbaji wa MDA na asidi trikloroasetiki 20% (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, Marekani) yenye 0.01% ya hidroksitoluini iliyo na buti (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Marekani). Kiwango cha MDA katika supernatant kisha kiliamuliwa kwa rangi kwa kupima unyonyaji katika 532 na 600 nm kwa kutumia spektrofotomita ya UV-160A (Shimadzu Corporation, Japani) na kisha kuonyeshwa kama nmol g−1 FW.
Kwa ajili ya tathmini ya vioksidishaji visivyo vya kimeng'enya na vimeng'enya, majani (ya pili na ya tatu yaliyokua kikamilifu kutoka juu) yalikusanywa kutoka kwa kila nakala ya kibiolojia baada ya saa 72 baada ya matibabu (hpt). Kila nakala ya kibiolojia ilihusisha vyungu vitano (mimea miwili kwa kila vyungu). Kila sampuli ya kibiolojia ilichambuliwa kwa nakala mbili (sampuli mbili za kiufundi). Majani mawili yalisagwa na nitrojeni kioevu na kutumika moja kwa moja kwa ajili ya kubaini vioksidishaji vya kimeng'enya na visivyo vya kimeng'enya, jumla ya asidi amino, kiwango cha prolini, usemi wa jeni, na kipimo cha oxalate.
Jumla ya fenoli zinazoyeyuka zilibainishwa kwa kutumia kitendanishi cha Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Marekani) kwa marekebisho madogo ya mbinu iliyoelezwa na Kahkonen et al. (1999). Kwa ufupi, takriban gramu 0.1 za tishu za majani zilizounganishwa zilitolewa na mililita 20 za methanoli 80% gizani kwa saa 24 na supernatant ilikusanywa baada ya kuzungushwa. Mililita 0.1 za dondoo la sampuli zilichanganywa na kitendanishi cha Folin-Ciocalteu 0.5 ml (10%), zikitikiswa kwa sekunde 30 na kuachwa gizani kwa dakika 5. Kisha mililita 0.5 za myeyusho wa kaboneti ya sodiamu 20% (Na2CO3; Kampuni ya Dawa na Vifaa vya Tiba ya Al-Gomhoria, Cairo, Misri) ziliongezwa kwenye kila mrija, zikachanganywa vizuri na kuwekwa kwenye joto la kawaida gizani kwa saa 1. Baada ya kuanguliwa, unyonyaji wa mchanganyiko wa mmenyuko ulipimwa kwa 765 nm kwa kutumia spektrofotomita ya UV-160A (Shimadzu Corporation, Japani). Mkusanyiko wa jumla ya fenoli mumunyifu katika dondoo za sampuli ulibainishwa kwa kutumia mkunjo wa urekebishaji wa asidi ya gallic (Fisher Scientific, Hampton, NH, Marekani) na kuonyeshwa kama miligramu za asidi ya gallic sawa kwa gramu ya uzito mpya (mg uzito mpya wa GAE g-1).
Jumla ya kiwango cha flavonoidi mumunyifu kiliamuliwa kulingana na mbinu ya Djeridane et al. (2006) pamoja na marekebisho madogo. Kwa kifupi, 0.3 ml ya dondoo ya methanoli hapo juu ilichanganywa na 0.3 ml ya myeyusho wa kloridi ya alumini 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, Marekani), ikichanganywa kwa nguvu na kisha kuangushwa kwenye joto la kawaida kwa dakika 5, ikifuatiwa na kuongezwa kwa 0.3 ml ya myeyusho wa asetati ya potasiamu 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Misri), ikichanganywa vizuri na kuangushwa kwenye joto la kawaida kwa dakika 30 gizani. Baada ya kuangushwa, ufyonzaji wa mchanganyiko wa mmenyuko ulipimwa kwa 430 nm kwa kutumia spectrophotometer ya UV-160A (Shimadzu Corporation, Japani). Mkusanyiko wa flavonoidi mumunyifu jumla katika dondoo za sampuli uliamuliwa kwa kutumia mkunjo wa urekebishaji wa rutin (TCI America, Portland, OR, Marekani) na kisha kuonyeshwa kama miligramu za rutin sawa kwa gramu ya uzito mpya (mg uzito mpya wa RE g-1).
Jumla ya asidi amino huru ya majani ya maharagwe ilibainishwa kwa kutumia kitendanishi kilichorekebishwa cha ninhydrin (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Marekani) kulingana na mbinu iliyopendekezwa na Yokoyama na Hiramatsu (2003) na kurekebishwa na Sun et al. (2006). Kwa kifupi, 0.1 g ya tishu iliyosagwa ilitolewa kwa kutumia pH 5.4 buffer, na 200 μL ya supernatant ilifanyiwa kazi na 200 μL ya ninhydrin (2%) na 200 μL ya pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, Marekani), iliyoangaziwa katika umwagaji wa maji yanayochemka kwa dakika 30, kisha ikapozwa na kupimwa kwa 580 nm kwa kutumia spectrophotometer ya UV-160A (Shimadzu Corporation, Japani). Kwa upande mwingine, proline ilibainishwa kwa kutumia mbinu ya Bates (Bates et al., 1973). Proline ilitolewa kwa kutumia asidi sulfosalicylic 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Marekani) na baada ya kuzungushwa, 0.5 ml ya supernatant ilichanganywa na 1 ml ya asidi asetiki ya barafu (Fisher Scientific, Hampton, NH, Marekani) na kitendanishi cha ninhydrin, kilichowekwa kwenye 90°C kwa dakika 45, kilipozwa na kupimwa kwa 520 nm kwa kutumia spectrophotometer sawa na hapo juu. Jumla ya amino asidi huru na proline katika dondoo za majani zilibainishwa kwa kutumia mikondo ya urekebishaji wa glycine na proline (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Marekani), mtawalia, na kuonyeshwa kama uzito mpya wa mg/g.
Ili kubaini shughuli ya kimeng'enya ya vimeng'enya vya antioxidant, takriban miligramu 500 za tishu zilizounganishwa zilitolewa kwa kutumia mililita 3 za Tris buffer ya 50 mM (pH 7.8) iliyo na 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Marekani) na polivinylpyrrolidone 7.5% (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Marekani), iliyotiwa centrifuge kwa 10,000 × g kwa dakika 20 chini ya jokofu (4 °C), na supernatant (dondoo la kimeng'enya ghafi) ilikusanywa (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Kisha katalasi (CAT) ilifanyiwa kazi na 2 ml ya bafa ya fosfeti ya sodiamu ya 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Marekani) na 100 μl ya myeyusho wa H2O2 wa 269 mM ili kubaini shughuli zake za kimeng'enya kulingana na mbinu ya Aebi (1984) pamoja na marekebisho madogo (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Shughuli ya kimeng'enya ya peroxidase (POX) inayotegemea Guaiacol ilibainishwa kwa kutumia mbinu ya Harrach et al. (2009). (2008) pamoja na marekebisho madogo (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) na shughuli ya kimeng'enya ya polifenoli oksidasi (PPO) ilibainishwa baada ya mmenyuko na 2.2 ml ya bafa ya fosfeti ya sodiamu ya 100 mM (pH 6.0), 100 μl ya guaiacol (kemikali za TCI, Portland, OR, Marekani) na 100 μl ya 12 mM H2O2. Mbinu hiyo ilibadilishwa kidogo kutoka (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Jaribio lilifanywa baada ya mmenyuko na 3 ml ya myeyusho wa katekesi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Marekani) (0.01 M) iliyoandaliwa hivi karibuni katika bafa ya fosfeti ya 0.1 M (pH 6.0). Shughuli ya CAT ilipimwa kwa kufuatilia mtengano wa H2O2 katika 240 nm (A240), shughuli ya POX ilipimwa kwa kufuatilia ongezeko la unyonyaji katika 436 nm (A436), na shughuli ya PPO ilipimwa kwa kurekodi mabadiliko ya unyonyaji katika 495 nm (A495) kila baada ya sekunde 30 kwa dakika 3 kwa kutumia spectrophotometer ya UV-160A (Shimadzu, Japani).
RT-PCR ya wakati halisi ilitumika kugundua viwango vya nakala ya jeni tatu zinazohusiana na antioxidant, ikiwa ni pamoja na katalasi ya peroxisomal (PvCAT1; Nambari ya Upatanishi wa GenBank KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; Nambari ya Upatanishi wa GenBank XM_068639556.1), na glutathione reductase (PvGR; Nambari ya Upatanishi wa GenBank KY195009.1), katika majani ya maharagwe (majani ya pili na ya tatu yaliyokua kikamilifu kutoka juu) saa 72 baada ya matibabu ya mwisho. Kwa kifupi, RNA ilitengwa kwa kutumia Kitengo cha Uchimbaji wa Simply P Total RNA (Nambari ya Cat. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) kulingana na itifaki ya mtengenezaji. Kisha, cDNA ilitengenezwa kwa kutumia Kitengo cha Upatanishi wa cDNA cha TOP script™ kulingana na maagizo ya mtengenezaji. Mfuatano wa awali wa jeni tatu hapo juu umeorodheshwa katika Jedwali la Ziada S3. PvActin-3 (Nambari ya kujiunga ya GenBank: XM_068616709.1) ilitumika kama jeni la utunzaji wa nyumba na usemi wa jeni husika ulihesabiwa kwa kutumia mbinu ya 2-ΔΔCT (Livak na Schmittgen, 2001). Uthabiti wa Actin chini ya msongo wa kibiolojia (mwingiliano usioendana kati ya kunde wa kawaida na kuvu wa anthracnose Colletotrichum lindemuthianum) na msongo wa abiotic (ukame, chumvi, joto la chini) ulionyeshwa (Borges et al., 2012).
Hapo awali tulifanya uchambuzi wa silika wa protini za oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) kwa ujumla katika jeni kwa kutumia zana ya protini-protini ya BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Kwa ufupi, tulitumia OAH kutoka Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; nambari ya upatanishi wa GenBank XP_040799428.1; amino asidi 342) na Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; nambari ya upatanishi wa GenBank XP_056833920.1; amino asidi 316) kama mfuatano wa hoja ili kuchora ramani ya protini inayofanana katika S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp ilifanywa dhidi ya data ya jenomu ya S. sclerotiorum iliyopatikana hivi karibuni katika GenBank kwenye tovuti ya Kituo cha Kitaifa cha Habari za Bioteknolojia (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Kwa kuongezea, jeni la OAH lililotabiriwa kutoka S. sclerotiorum (SsOAH) na uchambuzi wa mageuko na mti wa phylogenetic wa AfOAH kutoka A. fijiensis CBS 313.89 na PlOAH kutoka P. lagena zilihitimishwa kwa kutumia mbinu ya uwezekano mkubwa katika MEGA11 (Tamura et al., 2021) na modeli inayotegemea matrix ya JTT (Jones et al., 1992). Mti wa phylogenetic ulijumuishwa na uchambuzi wa mpangilio mwingi wa mfuatano wa protini wa jeni zote za OAH zilizotabiriwa (SsOAH) kutoka S. sclerotiorum na mfuatano wa hoja kwa kutumia Zana ya Mpangilio Uliozingatia Vizuizi (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos na Agarwala, 2007). Kwa kuongezea, mfuatano bora zaidi wa amino asidi unaolingana wa SsOAH kutoka S. sclerotiorum ulilinganishwa na mfuatano wa hoja (AfOAH na PlOAH) (Larkin et al., 2007) kwa kutumia ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), na maeneo yaliyohifadhiwa katika mpangilio yalionyeshwa kwa kutumia zana ya ESpript (toleo la 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESpript/ESpript/index.php).
Zaidi ya hayo, vikoa wakilishi vya utendaji vilivyotabiriwa na maeneo yaliyohifadhiwa ya S. sclerotiorum SsOAH yaligawanywa katika familia tofauti kwa kutumia zana ya InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Hatimaye, uundaji wa muundo wa pande tatu (3D) wa S. sclerotiorum SsOAH iliyotabiriwa ulifanywa kwa kutumia Injini ya Utambuzi wa Protini Homology/Analogy (seva ya Phyre2 toleo la 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) na kuthibitishwa kwa kutumia seva ya SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Miundo yenye pande tatu iliyotabiriwa (muundo wa PDB) ilionyeshwa kwa njia shirikishi kwa kutumia kifurushi cha UCSF-Chimera (toleo la 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
PCR ya fluorescence ya muda halisi ilitumika kubaini kiwango cha unukuzi wa oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; nambari ya upatanishi wa GenBank: XM_001590428.1) katika mycelia ya sclerotinia sclerotiorum. Kwa kifupi, S. sclerotiorum ilichanjwa ndani ya chupa iliyo na PDB na kuwekwa kwenye incubator inayotikisa (mfano: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, Marekani) kwa 25 ± 2 °C kwa saa 24 kwa kasi ya 150 rpm na gizani lisilobadilika (saa 24) ili kuchochea ukuaji wa mycelial. Baada ya hapo, seli zilitibiwa na L-ornithine na Rizolex-T ya kuvu katika viwango vya mwisho vya IC50 (takriban 40 na 3.2 mg/L, mtawalia) na kisha kupandwa kwa saa nyingine 24 chini ya hali zile zile. Baada ya kuanguliwa, tamaduni zilizungushwa kwa kasi ya 2500 rpm kwa dakika 5 na supernatant (mycelium ya fangasi) ilikusanywa kwa ajili ya uchambuzi wa usemi wa jeni. Vile vile, mycelium ya fangasi ilikusanywa kwa saa 0, 24, 48, 72, 96, na 120 baada ya kuambukizwa kutoka kwa mimea iliyoambukizwa ambayo ilikuwa imeunda ukungu mweupe na mycelium kama pamba kwenye uso wa tishu zilizoambukizwa. RNA ilitolewa kutoka kwa mycelium ya fangasi na kisha cDNA ilitengenezwa kama ilivyoelezwa hapo juu. Mfuatano wa awali wa SsOAH umeorodheshwa katika Jedwali la Ziada S3. SsActin (nambari ya uongezaji wa GenBank: XM_001589919.1) ilitumika kama jeni la utunzaji wa nyumba, na usemi wa jeni husika ulihesabiwa kwa kutumia mbinu ya 2-ΔΔCT (Livak na Schmittgen, 2001).
Asidi ya oxalic iligunduliwa katika mchuzi wa dextrose ya viazi (PDB) na sampuli za mimea zenye vimelea vya kuvu vya Sclerotinia sclerotiorum kulingana na mbinu ya Xu na Zhang (2000) pamoja na marekebisho madogo. Kwa kifupi, vipande vya S. sclerotiorum vilichanjwa kwenye chupa zenye PDB na kisha kupandwa katika kifaa cha kuangulia kinachotetemeka (modeli I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, Marekani) kwa kasi ya 150 rpm kwa kasi ya 25 ± 2 °C kwa siku 3-5 katika giza lisilobadilika (saa 24) ili kuchochea ukuaji wa mycelial. Baada ya kuangulia, utamaduni wa kuvu ulichujwa kwanza kupitia karatasi ya kuchuja ya Whatman #1 na kisha kuchujwa kwa kasi ya 2500 rpm kwa dakika 5 ili kuondoa mycelium iliyobaki. Supernatant ilikusanywa na kuhifadhiwa kwa joto la 4 °C kwa ajili ya kubaini zaidi kiasi cha oxalate. Kwa ajili ya kuandaa sampuli za mimea, takriban 0.1 g ya vipande vya tishu za mimea vilitolewa mara tatu kwa maji yaliyosafishwa (2 ml kila wakati). Sampuli zilichujwa kwa kutumia centrifuge kwa kasi ya 2500 rpm kwa dakika 5, supernatant ilichujwa kwa kutumia karatasi ya chujio ya Whatman No. 1 na kukusanywa kwa ajili ya uchambuzi zaidi.
Kwa uchanganuzi wa kiasi cha asidi ya oxaliki, mchanganyiko wa mmenyuko ulitayarishwa kwenye mrija uliowekwa kizuizi cha glasi kwa mpangilio ufuatao: 0.2 ml ya sampuli (au suluhisho la PDB culture filtrate au suluhisho la kawaida la asidi ya oxaliki), 0.11 ml ya bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, Marekani), 0.198 ml ya asidi ya sulfuriki 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Misri) na 0.176 ml ya dichromate ya potasiamu 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, Marekani), na kisha mchanganyiko huo ulipunguzwa hadi 4.8 ml na maji yaliyosafishwa, ukachanganywa kwa nguvu na kuwekwa mara moja kwenye bafu ya maji yenye joto la 60 °C. Baada ya dakika 10, mmenyuko huo ulisimamishwa kwa kuongeza 0.5 ml ya mchanganyiko wa hidroksidi ya sodiamu (NaOH; 0.75 M). Unyonyaji (A600) wa mchanganyiko wa mmenyuko ulipimwa kwa nm 600 kwa kutumia spektrofotomita ya UV-160 (Shimadzu Corporation, Japani). PDB na maji yaliyosafishwa yalitumika kama vidhibiti vya upimaji wa vichujio vya kitamaduni na sampuli za mimea, mtawalia. Viwango vya asidi ya oxalic katika vichujio vya kitamaduni, vilivyoonyeshwa kama mikrogramu za asidi ya oxalic kwa mililita ya kati ya PDB (μg.mL−1), na katika dondoo za majani, vilivyoonyeshwa kama mikrogramu za asidi ya oxalic kwa gramu ya uzito mpya (μg.g−1 FW), viliamuliwa kwa kutumia mkunjo wa urekebishaji wa asidi ya oxalic (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, Marekani).
Katika utafiti wote, majaribio yote yalibuniwa kwa muundo nasibu kabisa (CRD) ukiwa na nakala sita za kibiolojia kwa kila matibabu na vyungu vitano kwa kila nakala ya kibiolojia (mimea miwili kwa kila vyungu) isipokuwa kama imeelezwa vinginevyo. Nakala za kibiolojia zilichambuliwa kwa nakala mbili (nakala mbili za kiufundi). Nakala za kiufundi zilitumika kuangalia uwezekano wa kuzaliana kwa jaribio lile lile lakini hazikutumika katika uchanganuzi wa takwimu ili kuepuka nakala bandia. Data zilichambuliwa kwa kitakwimu kwa kutumia uchanganuzi wa tofauti (ANOVA) ikifuatiwa na jaribio la Tukey-Kramer la tofauti kubwa (HSD) (p ≤ 0.05). Kwa majaribio ya ndani ya vitro, thamani za IC50 na IC99 zilihesabiwa kwa kutumia modeli ya probit na vipindi vya kujiamini vya 95% vilihesabiwa.
Jumla ya mbegu nne zilizotengwa zilikusanywa kutoka mashamba tofauti ya soya katika Mkoa wa El Ghabiya, Misri. Kwenye mfumo wa PDA, mbegu zote zilizotengwa zilitoa mycelium nyeupe ya krimu ambayo ilibadilika haraka kuwa nyeupe kama pamba (Mchoro 1A) na kisha kuwa beige au kahawia katika hatua ya sclerotium. Sclerotia kwa kawaida huwa mnene, nyeusi, duara au isiyo ya kawaida katika umbo, urefu wa 5.2 hadi 7.7 mm na kipenyo cha 3.4 hadi 5.3 mm (Mchoro 1B). Ingawa mbegu nne zilizotengwa ziliunda muundo wa pembezoni wa sclerotia kwenye ukingo wa mfumo wa kilimo baada ya siku 10-12 za kuota kwa joto la 25 ± 2 °C (Mchoro 1A), idadi ya sclerotia kwa kila sahani ilikuwa tofauti sana miongoni mwao (P < 0.001), huku mbegu 3 ikitoa idadi kubwa zaidi ya sclerotia (sclerotia 32.33 ± 1.53 kwa kila sahani; Mchoro 1C). Vile vile, isolate #3 ilizalisha asidi oxalic zaidi katika PDB kuliko isolate nyingine (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Mchoro 1D). Isolate #3 ilionyesha sifa za kawaida za kimofolojia na hadubini za kuvu wa phytopathogenic Sclerotinia sclerotiorum. Kwa mfano, kwenye PDA, makoloni ya isolate #3 yalikua kwa kasi, yalikuwa meupe krimu (Mchoro 1A), beige ya kinyume au kahawia ya samoni nyepesi, na ilihitaji siku 6-7 kwa 25 ± 2°C ili kufunika kabisa uso wa bamba la kipenyo cha sentimita 9. Kulingana na sifa za kimofolojia na hadubini zilizo hapo juu, isolate #3 ilitambuliwa kama Sclerotinia sclerotiorum.
Mchoro 1. Sifa na vimelea vya vimelea vya S. sclerotiorum kutoka kwa mazao ya kawaida ya kunde. (A) Ukuaji wa mycelial wa vimelea vinne vya S. sclerotiorum kwenye kati ya PDA, (B) sclerotia ya vimelea vinne vya S. sclerotiorum, (C) idadi ya sclerotia (kwa kila sahani), (D) utolewaji wa asidi ya oxalic kwenye kati ya PDB (μg.mL−1), na (E) ukali wa ugonjwa (%) wa vimelea vinne vya S. sclerotiorum kwenye aina ya kunde ya kibiashara inayoweza kuathiriwa Giza 3 chini ya hali ya chafu. Thamani zinawakilisha wastani ± SD wa nakala tano za kibiolojia (n = 5). Herufi tofauti zinaonyesha tofauti kubwa za kitakwimu kati ya matibabu (p < 0.05). (F–H) Dalili za kawaida za ukungu mweupe zilionekana kwenye mashina ya juu ya ardhi na siliki, mtawalia, siku 10 baada ya chanjo na isolate #3 (dpi). (I) Uchambuzi wa mageuko wa eneo la ndani la spacer iliyoandikwa (ITS) la S. sclerotiorum isolate #3 ulifanywa kwa kutumia mbinu ya uwezekano mkubwa na ikilinganishwa na isolates/matatizo 20 ya marejeleo yaliyopatikana kutoka kwa hifadhidata ya Kituo cha Kitaifa cha Habari za Bioteknolojia (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Nambari zilizo juu ya mistari ya makundi zinaonyesha eneo linalofunika (%), na nambari zilizo chini ya mistari ya makundi zinaonyesha urefu wa tawi.
Zaidi ya hayo, ili kuthibitisha uwezekano wa kuambukizwa, vijidudu vinne vya S. sclerotiorum vilivyopatikana vilitumika kuchanja aina ya maharagwe ya kibiashara yanayoweza kuathiriwa na Giza 3 chini ya hali ya chafu, ambayo inaendana na vijidudu vya Koch (Mchoro 1E). Ingawa vijidudu vyote vya kuvu vilivyopatikana vilikuwa vya kuua na vingeweza kuambukiza maharagwe mabichi (cv. Giza 3), na kusababisha dalili za kawaida za ukungu mweupe kwenye sehemu zote zilizo juu ya ardhi (Mchoro 1F), haswa kwenye mashina (Mchoro 1G) na maganda (Mchoro 1H) siku 10 baada ya kuchanjwa (dpi), kijidudu 3 kilikuwa kijidudu kikubwa zaidi katika majaribio mawili huru. Kijidudu 3 kilikuwa na ukali wa juu zaidi wa ugonjwa (%) kwenye mimea ya maharagwe (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, na 76.7 ± 3.1 siku 7, 14, na 21 baada ya kuambukizwa, mtawalia; Mchoro 1F).
Utambuzi wa S. sclerotiorum isolate #3 vamizi zaidi ulithibitishwa zaidi kulingana na mpangilio wa ndani wa spacer iliyoandikwa (ITS) (Mchoro 1I). Uchambuzi wa phylogenetic kati ya isolate #3 na 20 reference isolate/strains ulionyesha kufanana kwa kiwango cha juu (>99%) kati yao. Inafaa kuzingatia kwamba S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) ina kufanana kwa kiwango cha juu na S. sclerotiorum isolate LPM36 ya Marekani iliyotengwa kutoka kwa mbegu kavu za njegere (nambari ya GenBank MK896659.1; 540 bp) na S. sclerotiorum isolate ya Kichina YKY211 (nambari ya GenBank accession OR206374.1; 548 bp), ambayo husababisha kuoza kwa shina la violet (Matthiola incana), ambayo yote yamepangwa kando juu ya dendrogram (Mchoro 1I). Mfuatano mpya umewekwa kwenye hifadhidata ya NCBI na kupewa jina la "Sclerotinia sclerotiorum - isolate YN-25" (nambari ya kujiunga ya GenBank PV202792). Inaweza kuonekana kwamba isolate 3 ndiyo isolate vamizi zaidi; kwa hivyo, isolate hii ilichaguliwa kwa ajili ya utafiti katika majaribio yote yaliyofuata.
Shughuli ya antibacterial ya diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Ujerumani) katika viwango tofauti (12.5, 25, 50, 75, 100 na 125 mg/L) dhidi ya S. sclerotiorum isolate 3 ilichunguzwa ndani ya vitro. Ni muhimu kukumbuka kuwa L-ornithine ilitoa athari ya antibacterial na polepole ilizuia ukuaji wa radial wa S. sclerotiorum hyphae kwa njia inayotegemea kipimo (Mchoro 2A, B). Katika viwango vya juu zaidi vilivyojaribiwa (125 mg/L), L-ornithine ilionyesha kiwango cha juu zaidi cha kuzuia ukuaji wa mycelial (99.62 ± 0.27%; Mchoro 2B), ambacho kilikuwa sawa na dawa ya kuvu ya kibiashara Rizolex-T (kiwango cha kuzuia 99.45 ± 0.39%; Mchoro 2C) katika viwango vya juu zaidi vilivyojaribiwa (10 mg/L), ikionyesha ufanisi sawa.
Mchoro 2. Shughuli ya antibacterial ya L-ornithine ndani ya vitro dhidi ya sclerotiorum ya Sclerotinia. (A) Ulinganisho wa shughuli ya antibacterial ya viwango tofauti vya L-ornithine dhidi ya S. sclerotiorum na dawa ya kuvu ya kibiashara ya Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Kiwango cha kizuizi (%) cha ukuaji wa mycelial ya S. sclerotiorum baada ya matibabu na viwango tofauti vya L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 na 125 mg/L) au Rizolex-T (2, 4, 6, 8 na 10 mg/L), mtawalia. Thamani zinawakilisha wastani ± SD wa nakala tano za kibiolojia (n = 5). Herufi tofauti zinaonyesha tofauti za takwimu kati ya matibabu (p < 0.05). (D, E) Uchambuzi wa urejelezaji wa modeli ya probit ya L-ornithine na dawa ya kuvu ya kibiashara ya Rizolex-T, mtawalia. Mstari wa urejeshaji wa modeli ya probiti unaonyeshwa kama mstari wa bluu thabiti, na muda wa kujiamini (95%) unaonyeshwa kama mstari mwekundu wenye vitone.
Zaidi ya hayo, uchambuzi wa urejelezaji wa probit ulifanywa na michoro inayolingana imeonyeshwa katika Jedwali la 1 na Michoro 2D,E. Kwa kifupi, thamani inayokubalika ya mteremko (y = 2.92x - 4.67) na takwimu muhimu zinazohusiana (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 na p < 0.0001; Mchoro 2D) wa L-ornithine ilionyesha shughuli iliyoimarishwa ya kuzuia fangasi dhidi ya S. sclerotiorum ikilinganishwa na dawa ya kuua fangasi ya kibiashara Rizolex-T (y = 1.96x - 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 na p < 0.0001) (Jedwali la 1).
Jedwali 1. Thamani za kiwango cha juu cha kuzuia (IC50) na IC99 (mg/l) ya L-ornithine na dawa ya kuvu ya kibiashara "Rizolex-T" dhidi ya S. sclerotiorum.
Kwa ujumla, L-ornithine (250 mg/L) ilipunguza kwa kiasi kikubwa ukuaji na ukali wa ukungu mweupe kwenye mimea ya maharagwe ya kawaida iliyotibiwa ikilinganishwa na mimea iliyoambukizwa na S. sclerotiorum isiyotibiwa (udhibiti; Mchoro 3A). Kwa kifupi, ingawa ukali wa ugonjwa wa mimea ya kudhibiti iliyoambukizwa isiyotibiwa uliongezeka polepole (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, na 92.33 ± 3.06%), L-ornithine ilipunguza kwa kiasi kikubwa ukali wa ugonjwa (%) katika jaribio lote (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, na 26.36 ± 3.07) katika siku 7, 14, na 21 baada ya matibabu (dpt), mtawalia (Mchoro 3A). Vile vile, mimea ya maharagwe iliyoambukizwa na S. sclerotiorum ilipotibiwa na 250 mg/L L-ornithine, eneo lililo chini ya mkondo wa kuendelea kwa ugonjwa (AUDPC) lilipungua kutoka 1274.33 ± 33.13 katika udhibiti ambao haukutibiwa hadi 281.03 ± 7.95, ambayo ilikuwa chini kidogo kuliko ile ya dawa chanya ya Rizolex-T ya kudhibiti 50 mg/L (183.61 ± 7.71; Mchoro 3B). Mwelekeo huo huo ulionekana katika jaribio la pili.
Mchoro 3. Athari ya matumizi ya nje ya L-ornithine kwenye ukuaji wa uozo mweupe wa maharagwe ya kawaida unaosababishwa na sclerotiorum ya Sclerotinia chini ya hali ya chafu. (A) Mkunjo wa ukuaji wa ugonjwa wa ukungu mweupe wa maharagwe ya kawaida baada ya matibabu na 250 mg/L L-ornithine. (B) Eneo chini ya mkunjo wa ukuaji wa ugonjwa (AUDPC) wa ukungu mweupe wa maharagwe ya kawaida baada ya matibabu na L-ornithine. Thamani zinawakilisha wastani ± SD wa nakala tano za kibiolojia (n = 5). Herufi tofauti zinaonyesha tofauti muhimu za kitakwimu kati ya matibabu (p < 0.05).
Matumizi ya nje ya 250 mg/L L-ornithine yaliongeza urefu wa mmea polepole (Mchoro 4A), idadi ya matawi kwa kila mmea (Mchoro 4B), na idadi ya majani kwa kila mmea (Mchoro 4C) baada ya siku 42. Ingawa dawa ya kuvu ya kibiashara ya Rizolex-T (50 mg/L) ilikuwa na athari kubwa zaidi kwa vigezo vyote vya lishe vilivyosomwa, matumizi ya nje ya 250 mg/L L-ornithine yalikuwa na athari ya pili kubwa ikilinganishwa na dawa za kudhibiti ambazo hazikutibiwa (Mchoro 4A–C). Kwa upande mwingine, matibabu ya L-ornithine hayakuwa na athari kubwa kwenye kiwango cha rangi za usanisinuru klorofili a (Mchoro 4D) na klorofili b (Mchoro 4E), lakini yaliongeza kidogo kiwango cha jumla cha karoteni (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) ikilinganishwa na udhibiti hasi (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) na udhibiti chanya (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Mchoro 4F). Kwa ujumla, matokeo haya yanaonyesha kuwa L-ornithine si sumu kwa mimea ya kunde iliyotibiwa na inaweza hata kuchochea ukuaji wake.
Mchoro 4. Athari ya matumizi ya L-ornithine ya nje kwenye sifa za ukuaji na rangi za usanisinuru za majani ya maharagwe yaliyoambukizwa na sclerotiorum ya Sclerotinia chini ya hali ya chafu. (A) Urefu wa mmea (cm), (B) Idadi ya matawi kwa kila mmea, (C) Idadi ya majani kwa kila mmea, (D) Kiwango cha klorofili a (mg g-1 fr wt), (E) Kiwango cha klorofili b (mg g-1 fr wt), (F) Jumla ya kiwango cha karotenoidi (mg g-1 fr wt). Thamani ni wastani wa ± SD wa nakala tano za kibiolojia (n = 5). Herufi tofauti zinaonyesha tofauti muhimu za kitakwimu kati ya matibabu (p < 0.05).
Ujanibishaji wa histokemikali wa spishi tendaji za oksijeni (ROS; iliyoonyeshwa kama peroksidi ya hidrojeni [H2O2]) na radicals huru (iliyoonyeshwa kama anions za superoxide [O2•−]) ulionyesha kuwa matumizi ya nje ya L-ornithine (250 mg/L) yalipunguza kwa kiasi kikubwa mkusanyiko wa H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Mchoro 5A) na O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Mchoro 5B) ikilinganishwa na mkusanyiko wa mimea yote miwili iliyoambukizwa ambayo haijatibiwa (173.31 ± 12.06 na 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, mtawalia) na mimea iliyotibiwa na 50 mg/L ya dawa ya kuvu ya kibiashara Rizolex-T (170.12 ± 9.50 na 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, mtawalia) saa 72. Viwango vya juu vya H2O2 na O2•− vilikusanywa chini ya hpt (Mchoro 5A, B). Vile vile, jaribio la malondialdehyde (MDA) linalotokana na TCA lilionyesha kuwa mimea ya maharagwe iliyoambukizwa na S. sclerotiorum ilikusanya viwango vya juu vya MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) kwenye majani yao (Mchoro 5C). Hata hivyo, matumizi ya nje ya L-ornithine yalipunguza kwa kiasi kikubwa uoksidishaji wa lipidi kama inavyothibitishwa na kupungua kwa kiwango cha MDA katika mimea iliyotibiwa (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Mchoro 5. Athari ya matumizi ya L-ornithine ya nje kwenye alama kuu za msongo wa oksidi na mifumo ya ulinzi wa antioxidant isiyo ya kimeng'enya katika majani ya maharagwe yaliyoambukizwa na S. sclerotiorum saa 72 baada ya kuambukizwa chini ya hali ya chafu. (A) Peroksidi ya hidrojeni (H2O2; nmol g−1 FW) saa 72 hpt, (B) anioni ya superoxide (O2•−; nmol g−1 FW) saa 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) saa 72 hpt, (D) fenoli zote mumunyifu (mg GAE g−1 FW) saa 72 hpt, (E) flavonoids zote mumunyifu (mg RE g−1 FW) saa 72 hpt, (F) jumla ya amino asidi huru (mg g−1 FW) saa 72 hpt, na (G) kiwango cha prolini (mg g−1 FW) saa 72 hpt. Thamani zinawakilisha wastani ± mkengeuko wa kawaida (wastani ± SD) wa nakala 5 za kibiolojia (n = 5). Herufi tofauti zinaonyesha tofauti muhimu za kitakwimu kati ya matibabu (p < 0.05).