Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo kwa CSS. Kwa matumizi bora, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime hali ya utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Chembe chembe ndogo za insulini (NPs) zenye kiwango cha juu cha upakiaji zimepata matumizi tofauti katika aina tofauti za kipimo. Kazi hii inalenga kutathmini athari za michakato ya kukausha kwa kugandisha na kukausha kwa kunyunyizia kwenye muundo wa chembe chembe ndogo za chitosan zilizojaa insulini, zikiwa na au bila mannitol kama kinga ya cryo. Pia tulitathmini ubora wa chembe chembe hizi ndogo kwa kuziyeyusha tena. Kabla ya upungufu wa maji mwilini, ukubwa wa chembe chembe ndogo za chitosan/sodiamu tripolyphosphate/insulini zilizounganishwa msalaba uliboreshwa kuwa 318 nm, PDI ilikuwa 0.18, ufanisi wa kufungia ulikuwa 99.4%, na upakiaji ulikuwa 25.01%. Baada ya uundaji upya, chembe chembe zote ndogo, isipokuwa zile zilizozalishwa kwa njia ya kukausha kwa kugandisha bila kutumia mannitol, zilidumisha muundo wao wa chembe za duara. Ikilinganishwa na chembe chembe ndogo zenye mannitol zilizokaushwa na dawa yoyote, chembe chembe ndogo zilizokaushwa bila dawa ya mannitol pia zilionyesha ukubwa mdogo zaidi wa chembe (376 nm) na kiwango cha juu zaidi cha upakiaji (25.02%). kwa kiwango sawa cha ufungashaji (98.7%) na PDI (0.20) kwa mbinu za kukausha au kukausha kwa kugandisha. Chembe chembe kavu kwa kukausha kwa kunyunyizia bila mannitol pia zilisababisha kutolewa kwa insulini kwa kasi zaidi na ufanisi mkubwa wa ufyonzaji wa seli. Kazi hii inaonyesha kwamba kukausha kwa kunyunyizia kunaweza kukamua chembe chembe za insulini bila kuhitaji vizuia-kryo ikilinganishwa na mbinu za kawaida za kukausha kwa kugandisha, na kuunda uwezo mkubwa wa upakiaji, mahitaji ya chini ya viongeza na gharama za uendeshaji faida kubwa.
Tangu ugunduzi wake mwaka wa 1922, 2, 3, insulini na maandalizi yake ya dawa yameokoa maisha ya wagonjwa wenye kisukari aina ya 1 (T1DM) na kisukari aina ya 2 (T1DM). Hata hivyo, kutokana na sifa zake kama protini yenye uzito mkubwa wa molekuli, insulini hukusanywa kwa urahisi, huvunjwa na vimeng'enya vya proteni, na kuondolewa kwa athari ya kwanza. Watu wanaogunduliwa na kisukari aina ya 1 wanahitaji sindano za insulini kwa maisha yao yote. Wagonjwa wengi waliogunduliwa awali na kisukari aina ya 2 pia wanahitaji sindano za insulini za muda mrefu. Sindano za insulini za kila siku ni chanzo kikubwa cha maumivu na usumbufu wa kila siku kwa watu hawa, na athari mbaya kwa afya ya akili. Matokeo yake, aina nyingine za utawala wa insulini ambazo husababisha usumbufu mdogo, kama vile utawala wa insulini kwa mdomo, zinachunguzwa kwa kina5 kwani zina uwezo wa kurejesha ubora wa maisha ya takriban watu bilioni 5 wenye kisukari duniani kote.
Teknolojia ya nanoparticle imetoa maendeleo makubwa katika majaribio ya kuchukua insulini ya mdomo4,6,7. Moja ambayo hufunika na kulinda insulini kutokana na uharibifu kwa ajili ya kupelekwa kwenye maeneo maalum ya mwili.Hata hivyo, matumizi ya fomula za nanoparticle yana mapungufu kadhaa, hasa kutokana na masuala ya uthabiti wa kusimamishwa kwa chembe.Mkusanyiko fulani unaweza kutokea wakati wa kuhifadhi, ambayo hupunguza upatikanaji wa bioavailability wa nanoparticles zilizojaa insulini8.Kwa kuongezea, uthabiti wa kemikali wa matrix ya polima ya nanoparticles na insulini lazima pia uzingatiwe ili kuhakikisha uthabiti wa nanoparticles za insulini (NPs).Kwa sasa, teknolojia ya kukausha kwa kugandisha ndiyo kiwango cha dhahabu cha kuunda NPs thabiti huku ikizuia mabadiliko yasiyotakikana wakati wa kuhifadhi9.
Hata hivyo, kukausha kwa kugandisha kunahitaji kuongezwa kwa vizuizi vya kinga ili kuzuia muundo wa duara wa NPs kuathiriwa na msongo wa mitambo wa fuwele za barafu. Hii hupunguza kwa kiasi kikubwa mzigo wa chembe chembe ndogo za insulini baada ya lyophilization, kwani kizuizi cha kinga huchukua sehemu kubwa ya uwiano wa uzito. Kwa hivyo, NP za insulini zinazozalishwa mara nyingi hupatikana kuwa hazifai kwa utengenezaji wa michanganyiko ya unga kavu, kama vile vidonge vya kumeza na filamu za kumeza, kutokana na hitaji la kiasi kikubwa cha chembe ndogo kavu ili kufikia dirisha la matibabu la insulini.
Kukausha kwa dawa ni mchakato unaojulikana na wa bei nafuu wa viwandani kwa ajili ya kutengeneza unga mkavu kutoka kwa awamu za kimiminika katika tasnia ya dawa10,11. Udhibiti wa mchakato wa uundaji wa chembe huruhusu ufungashaji sahihi wa misombo kadhaa hai ya kibiolojia 12, 13. Zaidi ya hayo, imekuwa mbinu bora ya kuandaa protini zilizofunikwa kwa ajili ya kumeza. Wakati wa kukausha kwa dawa, maji huvukiza haraka sana, ambayo husaidia kuweka halijoto ya kiini cha chembe chini11,14, na kuwezesha matumizi yake kuficha vipengele vinavyoathiriwa na joto. Kabla ya kukausha kwa dawa, nyenzo za mipako zinapaswa kuunganishwa vizuri na suluhisho lenye viungo vilivyofunikwa11,14. Tofauti na kukausha kwa kugandisha, ufungashaji kabla ya kuficha katika kukausha kwa dawa huboresha ufanisi wa kuficha wakati wa upungufu wa maji mwilini. Kwa kuwa mchakato wa kuficha kwa dawa hauhitaji vizuizi vya kupokanzwa, kukausha kwa dawa kunaweza kutumika kutoa NPs kavu zenye kiwango cha juu cha upakiaji.
Utafiti huu unaripoti uzalishaji wa NP zilizojaa insulini kwa kuunganisha chitosan na sodiamu tripolifosfeti kwa kutumia mbinu ya jeli ya ioni. Gelation ya ioni ni njia ya maandalizi ambayo inaruhusu uzalishaji wa chembe chembe ndogo kupitia mwingiliano wa umeme kati ya spishi mbili au zaidi za ioni chini ya hali fulani. Mbinu zote mbili za kukausha kwa kugandisha na kukausha kwa kunyunyizia zilitumika kukamua chembe chembe ndogo za chitosan/sodiamu tripolifosfeti/insulini zilizounganishwa kwa msalaba. Baada ya upungufu wa maji mwilini, mofolojia yao ilichambuliwa na SEM. Uwezo wao wa kuungana tena ulitathminiwa kwa kupima usambazaji wao wa ukubwa, chaji ya uso, PDI, ufanisi wa kufungia, na kiwango cha upakiaji. Ubora wa chembe chembe ndogo zilizoyeyushwa tena zinazozalishwa na mbinu tofauti za upungufu wa maji mwilini pia ulitathminiwa kwa kulinganisha ulinzi wao wa insulini, tabia ya kutolewa, na ufanisi wa ufyonzaji wa seli.
PH ya mchanganyiko wa myeyusho na uwiano wa chitosan na insulini ni mambo mawili muhimu yanayoathiri ukubwa wa chembe na ufanisi wa ufungashaji (EE) wa NP za mwisho, kwani zinaathiri moja kwa moja mchakato wa ugawaji wa ionotropiki. PH ya mchanganyiko wa myeyusho ilionyeshwa kuwa na uhusiano mkubwa na ukubwa wa chembe na ufanisi wa ufungashaji (Mchoro 1a). Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1a, pH ilipoongezeka kutoka 4.0 hadi 6.0, wastani wa ukubwa wa chembe (nm) ulipungua na EE iliongezeka kwa kiasi kikubwa, huku pH ilipoongezeka hadi 6.5, wastani wa ukubwa wa chembe ulianza kuongezeka na EE ilibaki bila kubadilika. Kadri uwiano wa chitosan na insulini unavyoongezeka, wastani wa ukubwa wa chembe pia huongezeka. Zaidi ya hayo, hakuna mabadiliko katika EE yaliyoonekana wakati nanochembe zilitayarishwa kwa uwiano wa wingi wa chitosan/insulini ulio juu kuliko 2.5:1 (w/w) (Mchoro 1b). Kwa hivyo, hali bora za maandalizi katika utafiti huu (pH 6.0, uwiano wa uzito wa chitosan/insulini wa 2.5:1) zilitumika Tayarisha chembe chembe zenye insulini kwa ajili ya utafiti zaidi. Chini ya hali hii ya maandalizi, ukubwa wa wastani wa chembe chembe za insulini uliboreshwa kuwa 318 nm (Mchoro 1c), PDI ilikuwa 0.18, ufanisi wa kupachika ulikuwa 99.4%, uwezo wa zeta ulikuwa 9.8 mv, na mzigo wa insulini ulikuwa 25.01% (m/m2). Kulingana na matokeo ya hadubini ya elektroni ya upitishaji (TEM), chembe chembe zilizoboreshwa zilikuwa za duara na zisizo na ukubwa wowote zenye ukubwa sawa (Mchoro 1d).
Uboreshaji wa vigezo vya chembe chembe ndogo za insulini: (a) athari ya pH kwenye kipenyo cha wastani na ufanisi wa ufungashaji (EE) wa chembe chembe ndogo za insulini (zilizoandaliwa kwa uwiano wa uzito wa 5:1 wa chitosan na insulini); (b) chitosan na Ushawishi wa uwiano wa wingi wa insulini kwenye kipenyo cha wastani na ufanisi wa ufungashaji (EE) wa NP za insulini (zilizoandaliwa kwa pH 6); (c) usambazaji wa ukubwa wa chembe wa chembe chembe ndogo za insulini zilizoboreshwa; (d) Mikrografu ya TEM ya NP za insulini zilizoboreshwa.
Inajulikana vyema kwamba chitosan ni polielektroliti dhaifu yenye pKa ya 6.5. Ina chaji chanya katika vyombo vya asidi kwa sababu kundi lake kuu la amino lina protoni na ioni za hidrojeni15. Kwa hivyo, mara nyingi hutumika kama kibebaji ili kukumbatia makromolekuli zenye chaji hasi. Katika utafiti huu, chitosan ilitumika kukumbatia insulini yenye ncha ya isoelektriki ya 5.3. Kwa kuwa chitosan hutumika kama nyenzo ya mipako, pamoja na ongezeko la uwiano wake, unene wa safu ya nje ya chembe chembe ndogo huongezeka ipasavyo, na kusababisha ukubwa wa wastani wa chembe kubwa zaidi. Zaidi ya hayo, viwango vya juu vya chitosan vinaweza kukumbatia insulini zaidi. Katika hali yetu, EE ilikuwa ya juu zaidi wakati uwiano wa chitosan na insulini ulifikia 2.5:1, na hakukuwa na mabadiliko makubwa katika EE wakati uwiano uliendelea kuongezeka.
Mbali na uwiano wa chitosan na insulini, pH pia ilichukua jukumu muhimu katika utayarishaji wa NPs. Gan et al. 17 walisoma athari ya pH kwenye ukubwa wa chembe za nanochembe za chitosan. Waligundua kupungua kwa ukubwa wa chembe hadi pH ilipofikia 6.0, na ongezeko kubwa la ukubwa wa chembe lilizingatiwa katika pH > 6.0, ambayo inaendana na uchunguzi wetu. Jambo hili linatokana na ukweli kwamba kwa kuongezeka kwa pH, molekuli ya insulini hupata chaji hasi ya uso, hivyo, ikipendelea mwingiliano wa umemetuamo na tata ya chitosan/sodium tripolyphosphate (TPP), na kusababisha ukubwa mdogo wa chembe na EE ya juu. Hata hivyo, pH iliporekebishwa hadi 6.5, vikundi vya amino kwenye chitosan viliondolewa protoni, na kusababisha kukunjwa kwa chitosan. Kwa hivyo, pH ya juu husababisha mfiduo mdogo wa amino kwa TPP na insulini, na kusababisha uunganishaji mdogo wa msalaba, ukubwa mkubwa wa wastani wa mwisho wa chembe na EE ya chini.
Uchambuzi wa sifa za kimofolojia za NP zilizokaushwa kwa kugandishwa na kukaushwa kwa dawa unaweza kuongoza uteuzi wa mbinu bora za uundaji wa maji mwilini na uundaji wa unga. Njia inayopendelewa inapaswa kutoa uthabiti wa dawa, umbo la chembe sawa, mzigo mkubwa wa dawa na umumunyifu mzuri katika suluhisho la asili. Katika utafiti huu, ili kulinganisha vyema mbinu hizo mbili, NP za insulini zenye au zisizo na 1% ya mannitol zilitumika wakati wa upungufu wa maji mwilini. Mannitol hutumika kama wakala wa kuongeza au kinga ya cryoprotective katika michanganyiko mbalimbali ya unga mkavu kwa ajili ya kukausha kwa kugandishwa na kukausha kwa kunyunyizia. Kwa chembe chembe za insulini zilizogandishwa bila mannitol, kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 2a, muundo wa unga wenye vinyweleo vingi wenye nyuso kubwa, zisizo za kawaida na mbaya ulionekana chini ya hadubini ya elektroni ya kuchanganua (SEM). Chembe chache tofauti ziligunduliwa kwenye unga baada ya upungufu wa maji mwilini (Mchoro 2e). Matokeo haya yalionyesha kuwa NP nyingi zilioza wakati wa kukausha kwa kugandishwa bila kinga yoyote ya cryoprotective. Kwa chembe chembe za insulini zilizokaushwa kwa kugandishwa na kukaushwa kwa dawa zenye 1% ya mannitol, chembe chembe za duara zenye nyuso laini zilizingatiwa (Mchoro 1). 2b,d,f,h).Chembe chembe ndogo za insulini zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol zilibaki duara lakini zimekunjamana juu ya uso (Mchoro 2c). Nyuso za duara na zenye mikunjo zinajadiliwa zaidi katika tabia ya kutolewa na majaribio ya ufyonzaji wa seli hapa chini. Kulingana na mwonekano unaoonekana wa NP zilizokaushwa, NP zote mbili zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol na NP ziligandishwa na kukaushwa kwa dawa kwa mannitol zilitoa poda laini za NP (Mchoro 2f,g,h). Kadiri eneo la uso kati ya nyuso za chembe linavyokuwa kubwa, ndivyo umumunyifu unavyoongezeka na kwa hivyo kiwango cha kutolewa kinavyokuwa juu.
Mofolojia ya NP tofauti za insulini zilizokaushwa: (a) Picha ya SEM ya NP za insulini zilizokaushwa bila mannitol; (b) Picha ya SEM ya NP za insulini zilizokaushwa na mannitol; (c) NP za insulini zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol Picha ya SEM ya ; (d) Picha ya SEM ya NP za insulini zilizokaushwa kwa dawa na mannitol; (e) picha ya unga wa NP za insulini zilizokaushwa bila mannitol; (f) picha ya NP za insulini zilizokaushwa na mannitol; (g) Picha ya unga wa NP za insulini zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol; (h) picha ya unga wa NP za insulini zilizokaushwa kwa dawa na mannitol.
Wakati wa kukausha kwa kugandisha, mannitol hufanya kazi kama kinga ya cryo, ikiweka NPs katika umbo lisilo na umbo na kuzuia uharibifu wa fuwele za barafu19. Kwa upande mwingine, hakuna hatua ya kugandisha wakati wa kukausha kwa kunyunyizia. Kwa hivyo mannitol haihitajiki katika njia hii. Kwa kweli, NPs zilizokaushwa kwa kunyunyizia bila mannitol zilitoa NPs nzuri zaidi kama ilivyoelezwa hapo awali. Hata hivyo, mannitol bado inaweza kufanya kazi kama kijazaji katika mchakato wa kukausha kwa kunyunyizia ili kuwapa NPs muundo wa duara zaidi20 (Mchoro 2d), ambao husaidia kupata tabia sawa ya kutolewa kwa NPs hizo zilizofunikwa. Kwa kuongezea, ni wazi kwamba baadhi ya chembe kubwa zinaweza kugunduliwa katika NPs za insulini zilizokaushwa kwa kugandisha na zilizokaushwa kwa kunyunyizia zenye mannitol (Mchoro 2b,d), ambayo inaweza kuwa kutokana na mkusanyiko wa mannitol kwenye kiini cha chembe pamoja na insulini iliyofunikwa. Kwa.Safu ya Chitosan. Ni muhimu kuzingatia kwamba katika utafiti huu, ili kuhakikisha kwamba muundo wa duara unabaki bila kuharibika baada ya upungufu wa maji mwilini, uwiano wa mannitol na chitosan huhifadhiwa katika 5:1, ili kiasi kikubwa cha kijazaji kiweze pia kupanua ukubwa wa chembe za NPs zilizokaushwa.
Spektroskopia ya jumla ya tafakari ya infrared iliyopunguzwa kwa infrared (FTIR-ATR) ilibainisha mchanganyiko halisi wa insulini huru, chitosan, chitosan, TPP na insulini. NP zote zilizokaushwa zilibainishwa kwa kutumia spektroskopia ya FTIR-ATR. Ikumbukwe kwamba, nguvu ya bendi ya 1641, 1543 na 1412 cm-1 ilionekana katika NP zilizofunikwa zilizokaushwa kwa kugandishwa na mannitol na katika NP zilizokaushwa kwa kunyunyizia na bila mannitol (Mchoro 3). Kama ilivyoripotiwa hapo awali, ongezeko hili la nguvu lilihusishwa na kuunganisha kati ya chitosan, TPP na insulini. Uchunguzi wa mwingiliano kati ya chitosan na insulini ulionyesha kuwa katika spektroskopia ya FTIR ya chembe chembe ndogo za chitosan zilizojaa insulini, bendi ya chitosan iliingiliana na ile ya insulini, na kuongeza kiwango cha kabonili (1641 cm-1) na ukanda wa amini (1543 cm-1). Vikundi vya tripolifosfeti vya TPP vimeunganishwa na vikundi vya amonia katika chitosan, na kutengeneza bendi yenye urefu wa sentimita 1412-1.
Spektra ya FTIR-ATR ya insulini huru, chitosan, mchanganyiko halisi wa chitosan/TPP/insulini na NPs zilizokaushwa kwa njia tofauti.
Zaidi ya hayo, matokeo haya yanaendana na yale yaliyoonyeshwa katika SEM, ambayo yalionyesha kuwa NP zilizofunikwa zilibaki bila kuharibika wakati wa kunyunyizia na kukaushwa kwa mannitol, lakini bila mannitol, kukausha kwa kunyunyizia pekee ndiko kulitoa chembe zilizofunikwa. Kwa upande mwingine, matokeo ya spektri ya FTIR-ATR ya NP zilizofungia bila mannitol yalikuwa sawa na mchanganyiko halisi wa chitosan, TPP, na insulini. Matokeo haya yanaonyesha kuwa viungo mtambuka kati ya chitosan, TPP na insulini havipo tena katika NP zilizofungia bila mannitol. Muundo wa NP uliharibiwa wakati wa kukausha kwa kufungia bila cryoprotector, ambayo inaweza kuonekana katika matokeo ya SEM (Mchoro 2a). Kulingana na mofolojia na matokeo ya FTIR ya NP za insulini zilizokaushwa, NP zilizofungiwa, na NP zisizo na mannitol pekee ndizo zilizotumika kwa majaribio ya urekebishaji na NP zisizo na mannitol kutokana na kuoza kwa NP zisizo na mannitol wakati wa upungufu wa maji mwilini. jadili.
Upungufu wa maji mwilini hutumika kwa ajili ya kuhifadhi kwa muda mrefu na kuchakata tena katika fomula zingine. Uwezo wa NP kavu kujijenga upya baada ya kuhifadhi ni muhimu kwa matumizi yao katika fomula tofauti kama vile vidonge na filamu. Tuligundua kuwa ukubwa wa wastani wa chembe za NP za insulini zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol uliongezeka kidogo tu baada ya kujijenga upya. Kwa upande mwingine, ukubwa wa chembe za chembe ndogo za insulini zilizokaushwa kwa dawa na kugandishwa zenye mannitol uliongezeka kwa kiasi kikubwa (Jedwali 1). PDI na EE hazikubadilishwa kwa kiasi kikubwa (p > 0.05) baada ya kujiunganisha tena kwa NP zote katika utafiti huu (Jedwali 1). Matokeo haya yanaonyesha kuwa chembe nyingi zilibaki zikiwa zimesalia baada ya kuyeyuka tena. Hata hivyo, kuongezwa kwa mannitol kulisababisha kupungua kwa kiasi kikubwa kwa upakiaji wa insulini wa chembe ndogo za mannitol zilizokaushwa na kunyunyiziwa (Jedwali 1). Kwa upande mwingine, kiwango cha mzigo wa insulini cha NP zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol kilibaki sawa na hapo awali (Jedwali 1).
Inajulikana vyema kwamba upakiaji wa chembe chembe ndogo ni muhimu inapotumika kwa madhumuni ya uwasilishaji wa dawa. Kwa NP zenye mzigo mdogo, kiasi kikubwa sana cha nyenzo kinahitajika ili kufikia kizingiti cha matibabu. Hata hivyo, mnato mkubwa wa viwango hivyo vya juu vya NP husababisha usumbufu na ugumu katika uwasilishaji wa mdomo na fomula za sindano, mtawalia 22. Zaidi ya hayo, NP za insulini zinaweza pia kutumika kutengeneza vidonge na biofilms zenye mnato 23, 24, ambazo zinahitaji matumizi ya kiasi kikubwa cha NPs katika viwango vya chini vya upakiaji, na kusababisha vidonge vikubwa na biofilms nene ambazo hazifai kwa matumizi ya mdomo. Kwa hivyo, NPs zilizokaushwa na maji mwilini zenye mzigo mkubwa wa insulini zinapendekezwa sana. Matokeo yetu yanaonyesha kwamba mzigo mkubwa wa insulini wa NPs zilizokaushwa bila dawa ya mannitol unaweza kutoa faida nyingi za kuvutia kwa njia hizi mbadala za uwasilishaji.
NP zote zilizokaushwa zilihifadhiwa kwenye jokofu kwa miezi mitatu. Matokeo ya SEM yalionyesha kuwa mofolojia ya NP zote zilizokaushwa haikubadilika sana wakati wa uhifadhi wa miezi mitatu (Mchoro 4). Baada ya kujengwa upya katika maji, NP zote zilionyesha kupungua kidogo kwa EE na kutoa takriban kiasi kidogo (~5%) cha insulini wakati wa kipindi cha uhifadhi wa miezi mitatu (Jedwali 2). Hata hivyo, ukubwa wa wastani wa chembe ndogo za nanochembe zote uliongezeka. Ukubwa wa chembe za NP zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol uliongezeka hadi 525 nm, huku ule wa NP zilizokaushwa kwa dawa na zilizogandishwa kwa mannitol uliongezeka hadi 872 na 921 nm, mtawalia (Jedwali 2).
Mofolojia ya NP tofauti za insulini zilizokaushwa zilizohifadhiwa kwa miezi mitatu: (a) Picha ya SEM ya NP za insulini zilizosafishwa zenye lyofili pamoja na mannitol; (b) Picha ya SEM ya chembe chembe ndogo za insulini zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol; (c) bila mannitol picha za SEM za NP za insulini zilizokaushwa kwa dawa.
Zaidi ya hayo, mvua zilionekana katika chembe chembe ndogo za insulini zilizokaushwa kwa dawa ya kunyunyizia na mannitol na kukaushwa kwa kugandishwa (Mchoro S2). Hii inaweza kusababishwa na chembe kubwa kutokusimama vizuri ndani ya maji. Matokeo yote hapo juu yanaonyesha kwamba mbinu ya kukausha dawa inaweza kulinda chembe chembe ndogo za insulini kutokana na upungufu wa maji mwilini na kwamba mzigo mkubwa wa chembe chembe ndogo za insulini unaweza kupatikana bila vijaza au vizuia kinga yoyote.
Uhifadhi wa insulini ulijaribiwa katika pH = 2.5 ya kati kwa kutumia pepsin, trypsin, na α-chymotrypsin ili kuonyesha uwezo wa kinga wa NPs dhidi ya usagaji wa kimeng'enya baada ya upungufu wa maji mwilini. Uhifadhi wa insulini wa NPs zilizokaushwa ulilinganishwa na ule wa NPs zilizoandaliwa hivi karibuni, na insulini huru ilitumika kama udhibiti hasi. Katika utafiti huu, insulini huru ilionyesha uondoaji wa insulini haraka ndani ya saa 4 katika matibabu yote matatu ya kimeng'enya (Mchoro 5a–c). Kwa upande mwingine, upimaji wa kuondoa insulini wa NPs zilizokaushwa kwa kugandishwa kwa mannitol na NPs zilizokaushwa kwa kunyunyizia dawa na au bila mannitol ulionyesha ulinzi mkubwa zaidi wa NPs hizi dhidi ya usagaji wa kimeng'enya, ambao ulikuwa sawa na ule wa NPs za insulini zilizoandaliwa hivi karibuni (mchoro 1).5a-c). Kwa msaada wa chembechembe ndogo katika pepsin, trypsin, na α-chymotrypsin, zaidi ya 50%, 60%, na 75% ya insulini ingeweza kulindwa ndani ya saa 4, mtawalia (Mchoro 5a–c). Uwezo huu wa kinga ya insulini unaweza kuongeza nafasi ya insulini ya juu. kunyonya ndani ya damu25. Matokeo haya yanaonyesha kwamba kukausha kwa kunyunyizia na au bila mannitol na kukausha kwa kugandisha kwa mannitol kunaweza kuhifadhi uwezo wa kinga ya insulini wa NPs baada ya upungufu wa maji mwilini.
Kinga na tabia ya kutolewa kwa NP za insulini zilizokaushwa: (a) ulinzi wa insulini katika suluhisho la pepsin; (b) ulinzi wa insulini katika suluhisho la trypsin; (c) ulinzi wa insulini kwa suluhisho la α-chymotrypsin; (d) Tabia ya kutolewa kwa NP zilizokaushwa katika pH = 2.5 myeyusho; (e) tabia ya kutolewa kwa NP zilizokaushwa katika pH = myeyusho wa 6.6; (f) tabia ya kutolewa kwa NP zilizokaushwa katika pH = myeyusho wa 7.0.
NP za insulini kavu zilizoandaliwa upya na kutengenezwa upya ziliwekwa kwenye vizuizi mbalimbali (pH = 2.5, 6.6, 7.0) kwa nyuzi joto 37, zikiiga mazingira ya pH ya tumbo, duodenum, na utumbo mdogo wa juu, ili kuchunguza athari ya insulini kwenye upinzani wa insulini. Tabia ya kutolewa katika mazingira tofauti. Kipande cha njia ya utumbo. Katika pH = 2.5, NP zilizojaa insulini na NP kavu za insulini zilizoyeyushwa tena zilionyesha kutolewa kwa awali kwa mlipuko ndani ya saa moja ya kwanza, ikifuatiwa na kutolewa polepole katika saa 5 zilizofuata (Mchoro 5d). Kutolewa huku kwa haraka mwanzoni kuna uwezekano mkubwa kuwa ni matokeo ya kufyonzwa haraka kwa molekuli za protini ambazo hazijazuiwa kikamilifu katika muundo wa ndani wa chembe. Katika pH = 6.5, NP zilizojaa insulini na NP kavu za insulini zilizoundwa upya zilionyesha kutolewa laini na polepole zaidi ya saa 6, kwani pH ya suluhisho la majaribio ilikuwa sawa na ile ya suluhisho lililoandaliwa na NPs (Mchoro 5e). Katika pH = 7, NP hazikuwa imara na karibu zilioza kabisa ndani ya saa mbili za kwanza (Mchoro 5f). Hii ni kwa sababu kuondolewa kwa chitosan hutokea katika pH ya juu, ambayo husababisha mtandao mdogo wa polima na kutolewa kwa insulini iliyojaa.
Zaidi ya hayo, NP za insulini zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol zilionyesha wasifu wa kutolewa haraka kuliko NP zingine zilizokaushwa (Mchoro 5d–f). Kama ilivyoelezwa hapo awali, NP za insulini zilizokaushwa upya bila mannitol zilionyesha ukubwa mdogo zaidi wa chembe. Chembe ndogo hutoa eneo kubwa la uso, kwa hivyo dawa nyingi husika zitakuwa karibu na uso wa chembe, na kusababisha kutolewa kwa dawa haraka26.
Sumu ya seli za NP ilichunguzwa kwa kutumia kipimo cha MTT. Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro S4, NP zote zilizokaushwa zilipatikana hazina athari kubwa kwenye uwezo wa seli kuishi katika viwango vya 50–500 μg/ml, ikidokeza kwamba NP zote zilizokaushwa zinaweza kutumika kwa usalama kufikia dirisha la matibabu.
Ini ndio kiungo kikuu ambacho insulini hutumia kazi zake za kisaikolojia. Seli za HepG2 ni safu ya seli ya hepatoma ya binadamu ambayo hutumika sana kama modeli ya ufyonzaji wa hepatocyte ndani ya vitro. Hapa, seli za HepG2 zilitumika kutathmini ufyonzaji wa seli za NP zilizokaushwa kwa kutumia mbinu za kukausha kwa kugandisha na kukausha kwa kunyunyizia. Ufyonzaji wa seli kwa kutumia skanning ya leza ya confocal kwa kutumia saitometri ya mtiririko na maono baada ya saa kadhaa za kuangushwa kwa kutumia insulini ya bure ya FITC katika mkusanyiko wa 25 μg/mL, NP zilizoandaliwa hivi karibuni za FITC zilizojaa insulini na NP zilizokaushwa kwa viwango sawa vya insulini Uchunguzi wa hadubini ya kiasi (CLSM) ulifanyika. NP zilizosafishwa bila mannitol ziliharibiwa wakati wa upungufu wa maji mwilini na hazikutathminiwa katika jaribio hili. Nguvu ya mwangaza wa ndani ya seli ya NP zilizoandaliwa hivi karibuni zilizojaa insulini, NP zilizosafishwa na mannitol, na NP zilizokaushwa kwa kunyunyizia zenye na bila mannitol (Mchoro 6a) zilikuwa 4.3, 2.6, 2.4, na Mara 4.1 zaidi kuliko zile huru. Kundi la insulini la FITC, mtawalia (Mchoro 6b). Matokeo haya yanaonyesha kwamba insulini iliyofunikwa ina nguvu zaidi katika ufyonzaji wa seli kuliko insulini huru, hasa kutokana na ukubwa mdogo wa chembe chembe ndogo zilizojaa insulini zilizozalishwa katika utafiti.
Ufyonzaji wa seli za HepG2 baada ya saa 4 za kupevuka na NP zilizoandaliwa hivi karibuni na NP zilizokaushwa: (a) Usambazaji wa ufyonzaji wa insulini ya FITC na seli za HepG2.(b) Wastani wa kijiometri wa nguvu za fluorescence uliochambuliwa kwa kutumia saitometri ya mtiririko (n = 3), *P < 0.05 ikilinganishwa na insulini huru.
Vile vile, picha za CLSM zilionyesha kuwa nguvu ya mwangaza wa FITC ya NP zilizoandaliwa hivi karibuni za FITC-insulin-loaded na NP zilizokaushwa kwa dawa za FITC-insulin-loaded (bila mannitol) zilikuwa na nguvu zaidi kuliko zile za sampuli zingine (Mchoro 6a). Zaidi ya hayo, kwa kuongezwa kwa mannitol, mnato mkubwa wa myeyusho uliongeza upinzani dhidi ya ufyonzaji wa seli, na kusababisha kupungua kwa kuenea kwa insulini. Matokeo haya yanaonyesha kuwa NP zilizokaushwa kwa dawa zisizo na mannitol zilionyesha ufanisi mkubwa zaidi wa ufyonzaji wa seli kwa sababu ukubwa wao wa chembe ulikuwa mdogo kuliko ule wa NP zilizokaushwa kwa kugandishwa baada ya kuyeyuka tena.
Chitosan (wastani wa uzito wa molekuli 100 KDa, 75–85% deasetilated) ilinunuliwa kutoka Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Sodium tripolyphosphate (TPP) ilinunuliwa kutoka VWR (Radnor, Pennsylvania, Marekani). Insulini ya binadamu iliyounganishwa tena iliyotumika katika utafiti huu ilitoka Fisher Scientific (Waltham, MA, Marekani). Insulini ya binadamu yenye lebo ya Fluorescein isothiocyanate (FITC) na 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) zilinunuliwa kutoka Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Mstari wa seli ya HepG2 ulipatikana kutoka ATCC (Manassas, Virginia, Marekani). Vitendanishi vingine vyote vilikuwa vya uchambuzi au daraja la kromatografi.
Andaa myeyusho wa 1 mg/ml wa CS kwa kuiyeyusha katika maji yaliyochanganywa mara mbili (maji ya DD) yenye asidi asetiki 0.1%. Andaa myeyusho wa 1 mg/ml wa TPP na insulini kwa kuiyeyusha katika maji ya DD na asidi asetiki 0.1%, mtawalia. Emulsion ya awali ilitayarishwa kwa kutumia homogenizer ya polytron PCU-2-110 yenye kasi ya juu (Brinkmann Ind. Westbury, NY, Marekani). Mchakato wa maandalizi ni kama ifuatavyo: kwanza, 2ml ya myeyusho wa TPP huongezwa kwenye 4ml ya myeyusho wa insulini, na mchanganyiko huo huchanganywa kwa dakika 30 na kuchanganywa kikamilifu. Kisha, myeyusho mchanganyiko uliongezwa kwa njia ya kushuka kwenye myeyusho wa CS kupitia sindano chini ya kuchochea kwa kasi ya juu (10,000 rpm). Michanganyiko iliwekwa chini ya kuchochea kwa kasi ya juu (15,000 rpm) katika umwagaji wa barafu kwa dakika 30, na ilirekebishwa kwa pH fulani ili kupata NP za insulini zilizounganishwa. Ili kuongeza usawa na kupunguza ukubwa wa chembe za NP za insulini, ziliongezwa kwa ajili ya ziada. Dakika 30 katika bafu ya barafu kwa kutumia kifaa cha kuoshea macho aina ya probe (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Ujerumani).
NPS ya Insulini ilijaribiwa kwa kipenyo cha wastani cha Z, kiashiria cha utofautishaji wa poli (PDI) na uwezo wa zeta kwa kutumia vipimo vya kutawanya mwanga kwa nguvu (DLS) kwa kutumia Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) kwa kuzipunguza katika maji ya DD kwa nyuzi joto 25. Muundo na usambazaji wa ukubwa ulibainishwa na darubini ya elektroni ya upitishaji ya Hitachi H7600 (TEM) (Hitachi, Tokyo, Japani), na picha baadaye zilichambuliwa kwa kutumia programu ya upigaji picha ya Hitachi (Hitachi, Tokyo, Japani). Ili kutathmini ufanisi wa ufungashaji (EE) na uwezo wa upakiaji (LC) wa NP za insulini, NP ziliingizwa kwenye mirija ya uchujaji wa ultrafiltration yenye kipimo cha uzito wa molekuli cha 100 kDa na kuzungushwa kwa 500 xg kwa dakika 30. Insulini isiyofunikwa kwenye kichujio ilipimwa kwa kutumia mfumo wa HPLC wa Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, California, Marekani) unaojumuisha pampu ya quaternary, kiotomatiki, safu wima. hita, na kigunduzi cha DAD. Insulini ilichambuliwa kwa kutumia safu wima ya C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) na kugunduliwa kwa 214 nm. Awamu ya kuhama ilikuwa asetonitrile na maji, yenye 0.1% TFA, uwiano wa gradient kutoka 10/90 hadi 100/0, na iliendeshwa kwa dakika 10. Awamu ya kuhama ilisukumwa kwa kiwango cha mtiririko cha 1.0 ml/dakika. Joto la safu wima liliwekwa hadi 20 °C. Hesabu asilimia za EE na LC kwa kutumia milinganyo.(1) na Eq.(2).
Uwiano mbalimbali wa CS/insulini kuanzia 2.0 hadi 4.0 ulijaribiwa ili kuboresha NP ya insulini. Kiasi tofauti cha suluhisho la CS kiliongezwa wakati wa maandalizi, huku mchanganyiko wa insulini/TPP ukidumishwa sawa. NP za insulini zilitayarishwa katika kiwango cha pH cha 4.0 hadi 6.5 kwa kudhibiti kwa uangalifu pH ya mchanganyiko baada ya kuongeza myeyusho yote (insulini, TPP na CS). Ukubwa wa EE na chembechembe ndogo za insulini zilitathminiwa kwa thamani tofauti za pH na uwiano wa uzito wa CS/insulini ili kuboresha uundaji wa NP za insulini.
NP za insulini zilizoboreshwa ziliwekwa kwenye chombo cha alumini na kufunikwa na tishu iliyofungwa kwa mkanda. Baadaye, vyombo vilivyowekwa skrubu viliwekwa kwenye kikaushio cha kugandisha cha Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, Marekani) kilicho na kikaushio cha trei. Halijoto na shinikizo la utupu viliwekwa kwa -10 °C, 0.350 Torr kwa saa 2 za kwanza, na 0 °C na 0.120 Torr kwa saa 22 zilizobaki za saa 24 ili kupata NP za insulini kavu.
Kikaushia Kidogo cha Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, Uswisi) kilitumika kutengeneza insulini iliyofunikwa. Vigezo vya kukausha vilivyochaguliwa vilikuwa: halijoto 100 °C, mtiririko wa malisho 3 L/dakika, na mtiririko wa gesi 4 L/dakika.
NP za Insulini kabla na baada ya upungufu wa maji mwilini zilibainishwa kwa kutumia spektroskopia ya FTIR-ATR. Chembe chembe ndogo zilizokaushwa maji pamoja na insulini huru na chitosan zilichambuliwa kwa kutumia spektrofotomita ya Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Marekani) iliyo na kifaa cha ziada cha sampuli ya ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Marekani). Wastani wa ishara ulipatikana kutoka kwa skani 16 kwa azimio la 4 cm2 katika masafa ya 4000-600 cm2.
Mofolojia ya NP za insulini kavu ilipimwa kwa kutumia picha za SEM za NP za insulini zilizokaushwa kwa kugandishwa na kukaushwa kwa kunyunyizia zilizopigwa picha na Hadubini ya Elektroni ya Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, Marekani). Kigezo kikuu kilichotumika kilikuwa volteji 5 keV na mkondo wa 30 mA.
NP zote za insulini zilizokaushwa ziliyeyushwa tena katika maji ya dd. Ukubwa wa chembe, PDI, EE na LC zilijaribiwa tena kwa kutumia njia ile ile iliyotajwa hapo awali ili kutathmini ubora wao baada ya upungufu wa maji mwilini. Uthabiti wa NP za anhydroinsulin pia ulipimwa kwa kupima sifa za NP baada ya kuhifadhi kwa muda mrefu. Katika utafiti huu, NP zote baada ya upungufu wa maji mwilini zilihifadhiwa kwenye jokofu kwa miezi mitatu. Baada ya miezi mitatu ya kuhifadhi, NP zilijaribiwa kwa ukubwa wa chembe za kimofolojia, PDI, EE na LC.
Yeyusha mililita 5 za NP zilizoundwa upya katika mililita 45 zenye umajimaji wa tumbo ulioigwa (pH 1.2, zenye 1% pepsin), umajimaji wa utumbo (pH 6.8, zenye 1% trypsin) au myeyusho wa chymotrypsin (100 g/mL, katika bafa ya fosfeti, pH 7.8) ili kutathmini ufanisi wa insulini katika kulinda NPs baada ya upungufu wa maji mwilini. Ziliwekwa kwenye incubation kwa 37°C kwa kasi ya kusisimua ya 100 rpm. 500 μL ya myeyusho ilikusanywa katika vipindi tofauti vya wakati na mkusanyiko wa insulini uliamuliwa na HPLC.
Tabia ya kutolewa kwa insulini NPs zilizoandaliwa hivi karibuni na zilizokaushwa ilijaribiwa kwa kutumia mbinu ya mfuko wa dialysis (kipimo cha uzito wa molekuli 100 kDa, Spectra Por Inc.). NPs kavu zilizoandaliwa hivi karibuni na zilizoundwa upya ziliwekwa kwenye dialysis katika vimiminika kwenye pH 2.5, pH 6.6, na pH 7.0 (0.1 M fosfeti-buffered saline, PBS) ili kuiga mazingira ya pH ya tumbo, duodenum, na utumbo mdogo wa juu, mtawalia. Sampuli zote ziliwekwa kwenye incubation kwa 37 °C huku zikitikiswa mfululizo kwa 200 rpm. Pumua maji nje ya mfuko wa dialysis wa mL 5 kwa nyakati zifuatazo: 0.5, 1, 2, 3, 4, na 6, na ujaze mara moja kiasi hicho na dialysate mpya. Uchafuzi wa insulini kwenye kioevu ulichambuliwa na HPLC, na kiwango cha kutolewa kwa insulini kutoka kwa chembe chembe kilihesabiwa kutoka kwa uwiano wa insulini huru iliyotolewa kwa jumla ya insulini iliyofunikwa kwenye chembe chembe (Mlinganyo 3).
Seli za HepG2 za mstari wa seli za saratani ya ini ya binadamu zilikuzwa katika sahani zenye kipenyo cha milimita 60 kwa kutumia Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) iliyo na seramu ya ng'ombe ya fetasi ya 10%, penicillin ya IU/mL 100, na streptomycin ya 100 μg/mL 29. Vipandikizi vilidumishwa kwa 37°C, unyevu wa 95%, na CO2 ya 5%. Kwa majaribio ya ufyonzaji, seli za HepG2 zilipandwa kwa seli 1 × 105/ml kwenye mfumo wa slaidi wa chumba cha Nunc Lab-Tek wenye visima 8 (Thermo Fisher, NY, Marekani). Kwa majaribio ya sumu ya seli, yalipandwa kwenye sahani za visima 96 (Corning, NY, Marekani) kwa msongamano wa seli 5 × 104/ml.
Kipimo cha MTT kilitumika kutathmini sumu ya seli za insulini NPs30 zilizoandaliwa hivi karibuni na zilizokaushwa. Seli za HepG2 zilipandwa katika sahani za visima 96 kwa msongamano wa seli 5 × 104/mL na kupandwa kwa siku 7 kabla ya majaribio. NPs za insulini zilipunguzwa hadi viwango mbalimbali (50 hadi 500 μg/mL) katika chombo cha kupandwa na kisha kupelekwa kwenye seli. Baada ya saa 24 za kupandwa, seli zilioshwa mara 3 na PBS na kupandwa na chombo cha kupandwa chenye 0.5 mg/ml MTT kwa saa 4 za ziada. Sumu ya seli ilipimwa kwa kupima upunguzaji wa kimeng'enya wa formazan ya njano ya tetrazolium hadi formazan ya zambarau kwa 570 nm kwa kutumia kisomaji cha sahani cha Tecan kisicho na kikomo cha M200 pro spectrophotometer (Tecan, Männedorf, Uswisi).
Ufanisi wa ufyonzaji wa seli wa NPs ulijaribiwa kwa kutumia hadubini ya skanning ya leza ya confocal na uchambuzi wa saitometri ya mtiririko. Kila kisima cha mfumo wa slaidi ya chumba cha Nunc Lab-Tek kilitibiwa na FITC-insulini ya bure, FITC-insulini-loaded NPs, na kurekebisha 25 μg/mL ya FITC-insulini NPs zilizokaushwa kwa kiwango sawa na kuwekwa kwenye incubation kwa saa 4. Seli zilioshwa mara 3 na PBS na kuwekwa na 4% paraformaldehyde. Nyuklia zilipakwa rangi ya 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Ujanibishaji wa insulini ulizingatiwa kwa kutumia skanning ya leza ya Olympus FV1000/darubini ya confocal ya fotoni mbili (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japani). Kwa uchambuzi wa saitometri ya mtiririko, viwango sawa vya 10 μg/mL FITC-insulini ya bure, FITC-insulini-loaded NPs, na FITC-insulini-dehydrated resolubilized. NP ziliongezwa kwenye sahani za visima 96 zilizopandwa na seli za HepG2 na kuwekwa kwenye incubation kwa saa 4. Baada ya saa 4 za incubation, seli ziliondolewa na kuoshwa mara 3 kwa kutumia FBS. Seli 5 × 104 kwa kila sampuli zilichambuliwa kwa kutumia saitomita ya mtiririko wa BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Marekani).
Thamani zote zinaonyeshwa kama wastani ± kupotoka kwa kawaida. Ulinganisho kati ya makundi yote ulipimwa kwa kutumia ANOVA ya njia moja au jaribio la t na IBM SPSS Statistics 26 kwa Mac (IBM, Endicott, New York, Marekani) na p < 0.05 ilizingatiwa kuwa muhimu kitakwimu.
Utafiti huu unaonyesha kunyumbulika na uwezo wa kukausha kwa dawa ili kuondoa maji kutoka kwa chembe chembe ndogo za chitosan/TPP/insulini zilizounganishwa kwa njia panda zenye uundaji upya bora ikilinganishwa na mbinu za kawaida za kukausha kwa kutumia mawakala wa kuganda au uwezo wa kuzuia maji mwilini na uwezo wa juu wa mzigo. Chembe chembe ndogo za insulini zilizoboreshwa zilitoa ukubwa wa wastani wa chembe wa 318 nm na ufanisi wa kufungia wa 99.4%. Matokeo ya SEM na FTIR baada ya upungufu wa maji mwilini yalionyesha kuwa muundo wa duara ulidumishwa tu katika NP zilizokaushwa kwa dawa zenye na bila mannitol na zilizosafishwa kwa mannitol, lakini NP zilizosafishwa bila mannitol zilioza wakati wa upungufu wa maji mwilini. Katika jaribio la uwezo wa kurekebisha, chembe chembe ndogo za insulini zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol zilionyesha ukubwa mdogo wa wastani wa chembe na mzigo mkubwa zaidi wakati wa kurekebisha. Tabia za kutolewa kwa NP hizi zote zilizokaushwa zilionyesha kuwa zilitolewa haraka katika myeyusho wa pH = 2.5 na pH = 7, na imara sana katika myeyusho wa pH = 6.5. Ikilinganishwa na NP zingine zilizokaushwa tena, NP zilikaushwa kwa dawa bila Mannitol ilionyesha kutolewa kwa kasi zaidi. Matokeo haya yanaendana na yale yaliyoonekana katika jaribio la ufyonzaji wa seli, kwani NP zilizokaushwa kwa dawa bila mannitol karibu zilidumisha ufanisi wa ufyonzaji wa seli wa NP zilizoandaliwa hivi karibuni. Matokeo haya yanaonyesha kwamba chembechembe ndogo za insulini kavu zilizotayarishwa na ukaushaji wa dawa usio na mannitol zinafaa zaidi kwa usindikaji zaidi katika aina zingine za kipimo kisicho na maji, kama vile vidonge vya kumeza au filamu za wambiso wa kibiolojia.
Kutokana na masuala ya miliki miliki, seti za data zinazozalishwa na/au kuchanganuliwa wakati wa utafiti wa sasa hazipatikani hadharani, lakini zinapatikana kutoka kwa waandishi husika kwa ombi linalofaa.
Kagan, A. Kisukari cha Aina ya 2: asili ya kijamii na kisayansi, matatizo ya kimatibabu, na athari kwa wagonjwa na wengine. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Ukuzaji wa ufungashaji wa insulini: je, utawala wa mdomo sasa unawezekana? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Maendeleo ya hivi karibuni katika mifumo ya utoaji wa liposomu iliyojaa insulini kwa ajili ya matibabu ya kisukari. Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).