Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo wa CSS. Kwa matokeo bora, tunapendekeza utumie toleo jipya la kivinjari chako (au zima Hali ya Utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mtindo au JavaScript.
Asidi ya Propioni (PPA) hutumika kusoma jukumu la kutofanya kazi vizuri kwa mitochondrial katika matatizo ya ukuaji wa neva kama vile ugonjwa wa wigo wa tawahudi. PPA inajulikana kuvuruga biogenesis ya mitochondrial, kimetaboliki, na mabadiliko. Hata hivyo, athari za PPA kwenye mienendo ya mitochondrial, mgawanyiko na muunganiko zinabaki kuwa tatizo kutokana na hali changamano ya muda ya mifumo hii. Hapa, tunatumia mbinu za upigaji picha za kiasi zinazosaidiana ili kuchunguza jinsi PPA inavyoathiri muundo wa mitochondrial, mofolojia, na mienendo katika seli za SH-SY5Y zinazofanana na niuroni. PPA (5 mM) ilisababisha kupungua kwa kiasi kikubwa kwa eneo la mitochondrial (p < 0.01), kipenyo na mzingo wa feret (p < 0.05), na eneo la 2 (p < 0.01). Uchambuzi wa kipata matukio ya mitochondrial ulionyesha ongezeko kubwa (p < 0.05) katika matukio ya muunganiko na muunganiko, na hivyo kudumisha uadilifu wa mtandao wa mitochondrial chini ya hali ya mkazo. Kwa kuongezea, usemi wa mRNA wa cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) na OPA1 (p < 0.05) ulipunguzwa sana. 01). Hii inaonyesha urekebishaji wa mofolojia ya mitochondrial, biogenesis na mienendo ili kudumisha utendakazi chini ya hali ya mfadhaiko. Data yetu hutoa ufahamu mpya kuhusu athari za PPA kwenye mienendo ya mitochondrial na inaangazia matumizi ya mbinu za upigaji picha kwa ajili ya kusoma mifumo tata ya udhibiti inayohusika katika majibu ya mfadhaiko wa mitochondrial.
Mitochondria ni washiriki muhimu katika kazi mbalimbali za seli zaidi ya majukumu yao ya kawaida katika uzalishaji wa nishati na biosynthesis. Umetaboli wa Mitochondria ni mdhibiti muhimu wa ishara ya kalsiamu, homeostasis ya kimetaboliki na redoksi, ishara ya uchochezi, marekebisho ya epigenetic, kuongezeka kwa seli, utofautishaji na kifo cha seli kilichopangwa1. Hasa, metaboli ya mitochondria ni muhimu kwa ukuaji wa neva, kuishi na utendaji kazi na inahusishwa sana katika udhihirisho mbalimbali wa neuropatholojia2,3,4.
Katika muongo mmoja uliopita, hali ya kimetaboliki imeibuka kama mdhibiti mkuu wa neurogenesis, utofautishaji, ukomavu na unyumbufu5,6. Hivi karibuni, mofolojia na mienendo ya mitochondria vimekuwa vipengele muhimu sana vya mitosisi, mchakato unaobadilika unaodumisha dimbwi la mitochondria yenye afya ndani ya seli. Mienendo ya mitochondria inadhibitiwa na njia ngumu zinazotegemeana kuanzia biogenesis ya mitochondria na bioenergetics hadi mgawanyiko wa mitochondria, muunganiko, usafirishaji na uwazi7,8. Usumbufu wa yoyote kati ya mifumo hii ya ujumuishaji huathiri utunzaji wa mitandao yenye afya ya mitochondria na una athari kubwa za utendaji kazi kwa ukuaji wa neva9,10. Hakika, uchakavu wa mienendo ya mitochondria huzingatiwa katika matatizo mengi ya akili, uharibifu wa neva na ukuaji wa neva, ikiwa ni pamoja na matatizo ya wigo wa tawahudi (ASD)11,12.
ASD ni ugonjwa wa ukuaji wa neva usio wa kawaida wenye usanifu tata wa kijenetiki na epigenetic. Urithi wa ASD haupingiki, lakini etiolojia ya molekuli ya msingi bado haieleweki vizuri. Kukusanya data kutoka kwa mifano ya kabla ya kliniki, tafiti za kliniki, na seti za data za molekuli za omiki nyingi hutoa ushahidi unaoongezeka wa kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria katika ASD13,14. Hapo awali tulifanya uchunguzi wa methylation ya DNA pana katika kundi la wagonjwa walio na ASD na kutambua jeni zenye methili tofauti zilizokusanywa kando ya njia za kimetaboliki za mitochondria15. Baadaye tuliripoti methylation tofauti ya vidhibiti vikuu vya biogenesis na mienendo ya mitochondria, ambayo ilihusishwa na idadi kubwa ya nakala ya mtDNA na mabadiliko ya wasifu wa kimetaboliki ya mkojo katika ASD16. Data yetu inatoa ushahidi unaoongezeka kwamba mienendo ya mitochondria na homeostasis huchukua jukumu kuu katika pathophysiolojia ya ASD. Kwa hivyo, kuboresha uelewa wa kiufundi wa uhusiano kati ya mienendo ya mitochondria, mofolojia, na utendakazi ni lengo muhimu la utafiti unaoendelea kuhusu magonjwa ya neva yanayoonyeshwa na kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria kwa sekondari.
Mbinu za molekuli mara nyingi hutumika kusoma jukumu la jeni maalum katika majibu ya msongo wa mitochondria. Hata hivyo, mbinu hii inaweza kupunguzwa na asili ya pande nyingi na ya muda ya mifumo ya udhibiti wa mitotiki. Zaidi ya hayo, usemi tofauti wa jeni za mitochondria ni kiashiria kisicho cha moja kwa moja cha mabadiliko ya utendaji kazi, hasa kwa kuwa ni idadi ndogo tu ya jeni huchambuliwa kwa kawaida. Kwa hivyo, mbinu za moja kwa moja zaidi za kusoma utendaji kazi wa mitochondria na bioenergetics zimependekezwa17. Mofolojia ya mitochondria inahusiana kwa karibu na mienendo ya mitochondria. Umbo, muunganisho, na muundo wa mitochondria ni muhimu kwa uzalishaji wa nishati na uhai wa mitochondria na seli5,18. Zaidi ya hayo, vipengele mbalimbali vya mitosisi huzingatia mabadiliko katika mofolojia ya mitochondria, ambayo yanaweza kutumika kama mwisho muhimu wa kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria na kutoa msingi wa masomo ya baadaye ya kiufundi.
Mofolojia ya mitochondria inaweza kuzingatiwa moja kwa moja kwa kutumia hadubini ya elektroni ya upitishaji (TEM), kuruhusu utafiti wa kina wa muundo wa seli. TEM huonyesha moja kwa moja mofolojia, umbo na muundo wa cristae ya mitochondria katika utatuzi wa mitochondria ya mtu binafsi, badala ya kutegemea tu unukuzi wa jeni, usemi wa protini au vigezo vya utendaji kazi wa mitochondria katika idadi ya seli17,19,20. Kwa kuongezea, TEM hurahisisha utafiti wa mwingiliano kati ya mitochondria na ogani zingine, kama vile retikulamu ya endoplasmi na autophagosomu, ambazo zina jukumu muhimu katika utendaji kazi wa mitochondria na homeostasis21,22. Kwa hivyo, hii inafanya TEM kuwa mahali pazuri pa kuanzia kusoma utendakazi mbaya wa mitochondria kabla ya kuzingatia njia au jeni maalum. Kadri utendaji kazi wa mitochondria unavyozidi kuwa muhimu kwa neuropatholojia, kuna haja ya wazi ya kuweza kusoma moja kwa moja na kwa kiasi mofolojia na mienendo ya mitochondria katika mifano ya neva ya vitro.
Katika makala haya, tunachunguza mienendo ya mitochondria katika mfumo wa neva wa kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria katika ugonjwa wa wigo wa tawahudi. Hapo awali tuliripoti tofauti ya methylation ya propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) katika ASD15, kitengo kidogo cha kimeng'enya cha mitochondria cha propionyl-CoA carboxylase PCC. Uharibifu wa PCC unajulikana kusababisha mkusanyiko wa sumu wa derivatives za propionyl, ikiwa ni pamoja na asidi ya propionic (PPA)23,24,25. PPA imeonyeshwa kuvuruga metaboli ya niuroni na kubadilisha tabia mwilini na ni mfumo ulioanzishwa wa wanyama wa kusoma mifumo ya ukuaji wa niuroni inayohusika katika ASD26,27,28. Zaidi ya hayo, PPA imeripotiwa kuvuruga uwezo wa utando wa mitochondria, biogenesis na upumuaji mwilini na imetumika sana kuiga kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria katika niuroni29,30. Hata hivyo, athari ya kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria kunakosababishwa na PPA kwenye mofolojia na mienendo ya mitochondria bado haijaeleweka vizuri.
Utafiti huu unatumia mbinu za upigaji picha zinazosaidiana ili kupima athari za PPA kwenye mofolojia ya mitochondrial, mienendo, na utendakazi katika seli za SH-SY5Y. Kwanza, tulitengeneza mbinu ya TEM ili kuibua mabadiliko katika mofolojia ya mitochondrial na muundo wa hali ya juu17,31,32. Kwa kuzingatia asili ya mienendo ya mitochondria33, pia tulitumia uchanganuzi wa kitambulisho cha matukio ya mitochondrial (MEL) ili kupima mabadiliko katika usawa kati ya matukio ya mgawanyiko na muunganiko, idadi ya mitochondrial na ujazo chini ya mkazo wa PPA. Hatimaye, tulichunguza kama mofolojia na mienendo ya mitochondrial zinahusishwa na mabadiliko katika usemi wa jeni zinazohusika katika biogenesis, mgawanyiko, na muunganiko. Kwa pamoja, data yetu inaonyesha changamoto ya kufafanua ugumu wa mifumo inayodhibiti mienendo ya mitochondrial. Tunaangazia manufaa ya TEM katika kusoma mofolojia ya mitochondrial kama mwisho unaoweza kupimika wa mitosis katika seli za SH-SY5Y. Zaidi ya hayo, tunaangazia kwamba data ya TEM hutoa taarifa bora zaidi inapojumuishwa na mbinu za upigaji picha ambazo pia hunasa matukio yanayobadilika kulingana na mkazo wa kimetaboliki. Uainishaji zaidi wa mifumo ya udhibiti wa molekuli inayounga mkono mitosisi ya seli za neva unaweza kutoa ufahamu muhimu kuhusu sehemu ya mitochondria ya mfumo wa neva na magonjwa ya neva yanayoharibika.
Ili kusababisha msongo wa mitochondria, seli za SH-SY5Y zilitibiwa na PPA kwa kutumia propionate ya sodiamu ya 3 mM na 5 mM (NaP). Kabla ya TEM, sampuli zilifanyiwa maandalizi ya sampuli ya cryogenic kwa kutumia kuganda na kugandisha kwa shinikizo kubwa (Mchoro 1a). Tulitengeneza bomba la uchambuzi wa picha za mitochondria otomatiki ili kupima vigezo nane vya kimofolojia vya idadi ya mitochondria katika nakala tatu za kibiolojia. Tuligundua kuwa matibabu ya PPA yalibadilisha kwa kiasi kikubwa vigezo vinne: eneo la 2, eneo, mzunguko, na kipenyo cha Feret (Mchoro 1b–e). Eneo la 2 lilipungua kwa kiasi kikubwa kwa matibabu ya PPA ya 3 mM na 5 mM (p = 0.0183 na p = 0.002, mtawalia) (Mchoro 1b), huku eneo (p = 0.003), mzunguko (p = 0.0106) na kipenyo cha Feret vyote vimepungua kwa kiasi kikubwa. Kulikuwa na upunguzaji mkubwa (p = 0.0172) katika kundi la matibabu la 5 mM ikilinganishwa na kundi la udhibiti (Mchoro 1c–e). Kupungua kwa kiasi kikubwa kwa eneo na mzingo kulionyesha kuwa seli zilizotibiwa na PPA ya mM 5 zilikuwa na mitochondria ndogo na zenye mviringo zaidi, na kwamba mitochondria hizi zilikuwa na urefu mdogo kuliko zile zilizo kwenye seli za udhibiti. Hii pia inaendana na kupungua kwa kiasi kikubwa kwa kipenyo cha Feret, kigezo huru kinachoonyesha kupungua kwa umbali mkubwa zaidi kati ya kingo za chembe. Mabadiliko katika muundo wa juu wa cristae yalionekana: cristae ilipungua kutamkwa chini ya ushawishi wa msongo wa PPA (Mchoro 1a, paneli B). Hata hivyo, si picha zote zilizoonyesha wazi muundo wa juu wa cristae, kwa hivyo uchambuzi wa kiasi wa mabadiliko haya haukufanywa. Data hizi za TEM zinaweza kuonyesha matukio matatu yanayowezekana: (1) PPA huongeza mgawanyiko au kuzuia muunganiko, na kusababisha mitochondria iliyopo kupungua kwa ukubwa; (2) biogenesis iliyoimarishwa huunda mitochondria mpya, ndogo au (3) husababisha mifumo yote miwili kwa wakati mmoja. Ingawa hali hizi haziwezi kutofautishwa na TEM, mabadiliko makubwa ya kimofolojia yanaonyesha mabadiliko katika homeostasis ya mitochondrial na mienendo chini ya msongo wa PPA. Baadaye tulichunguza vigezo vya ziada ili kuainisha zaidi mienendo hii na mifumo inayowezekana inayoizunguka.
Asidi ya Propioni (PPA) hurekebisha umbo la mitochondria. (a) Picha wakilishi za hadubini ya elektroni ya uenezaji (TEM) zinazoonyesha kuwa ukubwa wa mitochondria hupungua na mitochondria inakuwa ndogo na yenye mviringo zaidi huku matibabu ya PPA yakiongezeka; 0 mM (isiyotibiwa), 3 mM na 5 mM, mtawalia. Mishale nyekundu inaonyesha mitochondria. (b–e) Seli za SH-SY5Y zilizotibiwa na PPA kwa saa 24 zilitayarishwa kwa ajili ya TEM na matokeo yalichambuliwa kwa kutumia Fiji/ImageJ. Vigezo vinne kati ya vinane vilionyesha tofauti kubwa kati ya seli za udhibiti (zisizotibiwa, 0 mM PPA) na seli za kutibiwa (3 mM na 5 mM PPA). (b) Eneo la 2, (c) Eneo, (d) Mzunguko, (e) Kipenyo cha Feret. Uchambuzi wa njia moja wa tofauti (udhibiti dhidi ya matibabu) na jaribio la kulinganisha nyingi la Dunnett vilitumika kubaini tofauti kubwa (p < 0.05). Pointi za data zinawakilisha thamani ya wastani ya mitochondria kwa kila seli ya mtu binafsi, na pau za makosa zinawakilisha wastani wa ± SEM. Data iliyoonyeshwa inawakilisha n = 3, angalau seli 24 kwa kila nakala; jumla ya picha 266 zilichambuliwa; * inaonyesha p < 0.05, ** inaonyesha p < 0.01.
Ili kubainisha zaidi jinsi mienendo ya mitochondria inavyoitikia PPA, tulipaka rangi mitochondria na tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) na kutumia hadubini ya muda mfupi na uchambuzi wa MEL ili kubaini na kupima mitochondria baada ya saa 24 katika PPA ya 3 na 5 mM. Matibabu ya matukio ya mgawanyiko na muunganiko. (Mchoro 2a). Baada ya uchambuzi wa MEL, mitochondria ilichambuliwa zaidi ili kupima idadi ya miundo ya mitochondria na ujazo wake wa wastani. Tuliona ongezeko dogo lakini kubwa la idadi ya matukio ya mgawanyiko yaliyotokea katika 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] ikilinganishwa na mgawanyiko [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] na mchanganyiko [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] na mchanganyiko [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] matukio yaliongezeka kwa kiasi kikubwa katika 5 mM ikilinganishwa na udhibiti (Mchoro 3b). Idadi ya mitochondria iliongezeka kwa kiasi kikubwa katika 3 zote mbili [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] na 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Mchoro 3c), huku ujazo wa wastani wa kila muundo wa mitochondria ukibaki bila kubadilika (Mchoro 3c). 3d). Kwa ujumla, hii inaonyesha kwamba urekebishaji wa mienendo ya mitochondrial hutumika kama mwitikio wa fidia unaodumisha uadilifu wa mtandao wa mitochondrial kwa mafanikio. Ongezeko la idadi ya matukio ya mgawanyiko katika PPA ya mM 3 linaonyesha kwamba ongezeko la idadi ya mitochondrial linatokana kwa kiasi fulani na mgawanyiko wa mitochondrial, lakini ikizingatiwa kwamba wastani wa ujazo wa mitochondrial bado haujabadilika kimsingi, biogenesis haiwezi kutengwa kama mwitikio wa ziada wa fidia. Hata hivyo, data hizi zinaendana na miundo midogo ya mitochondrial iliyozungukwa na TEM na pia zinaonyesha mabadiliko makubwa katika mienendo ya mitochondrial inayosababishwa na PPA.
Asidi ya Propioni (PPA) huchochea urekebishaji wa mitochondria unaobadilika ili kudumisha uadilifu wa mtandao. Seli za SH-SY5Y zilikuzwa, zikatibiwa na PPA ya 3 na 5 mM kwa saa 24 na kupakwa rangi ya TMRE na Hoechst 33342 ikifuatiwa na uchambuzi wa MEL. (a) Picha wakilishi za hadubini ya muda zinazoonyesha rangi na makadirio ya kiwango cha juu cha binari kwa wakati wa 2 (t2) kwa kila hali. Maeneo yaliyochaguliwa yaliyoonyeshwa katika kila picha ya binary yanaimarishwa na kuonyeshwa katika 3D kwa vipindi vitatu tofauti vya muda (t1-t3) ili kuonyesha mienendo baada ya muda; matukio ya muunganiko yanaangaziwa kwa kijani kibichi; matukio ya mgawanyiko yanaangaziwa kwa kijani kibichi. Yanaonyeshwa kwa rangi nyekundu. (b) Idadi ya wastani ya matukio yanayobadilika kwa kila hali. (c) Idadi ya wastani ya miundo ya mitochondria kwa kila seli. (d) Kiasi cha wastani (µm3) cha kila muundo wa mitochondria kwa kila seli. Data iliyoonyeshwa inawakilisha n = seli 15 kwa kila kundi la matibabu. Pau za hitilafu zilizoonyeshwa zinawakilisha wastani ± SEM, upau wa kipimo = 10 μm, * p < 0.05.
Asidi ya propioni (PPA) husababisha ukandamizaji wa unukuzi wa jeni zinazohusiana na mienendo ya mitochondrial. Seli za SH-SY5Y zilitibiwa na PPA ya 3 na 5 mM kwa saa 24. Upimaji wa jeni husika ulifanywa kwa kutumia RT-qPCR na kurekebishwa kuwa B2M. Jeni za biogenesis ya Mitochondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 na (d) NFE2L2. Jeni za muunganiko na mgawanyiko wa Mitochondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 na (i) DRP1. Tofauti kubwa (p < 0.05) zilijaribiwa kwa kutumia ANOVA ya njia moja (udhibiti dhidi ya matibabu) na jaribio la kulinganisha nyingi la Dunnett: * inaonyesha p < 0.05, ** inaonyesha p < 0.01, na **** inaonyesha p < 0.0001. Pau zinawakilisha usemi wa wastani ± SEM. Data iliyoonyeshwa inawakilisha n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), na n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) nakala za kibiolojia.
Takwimu kutoka kwa uchambuzi wa TEM na MEL kwa pamoja zinaonyesha kuwa PPA hubadilisha umbo na mienendo ya mitochondria. Hata hivyo, mbinu hizi za upigaji picha hazitoi ufahamu kuhusu mifumo ya msingi inayoendesha michakato hii. Kwa hivyo, tulichunguza usemi wa mRNA wa vidhibiti tisa muhimu vya mienendo ya mitochondria, biogenesis, na mitosis katika kukabiliana na matibabu ya PPA. Tulipima onkojeni ya myeloma ya seli (cMYC), kipengele cha kupumua cha nyuklia (NRF1), kipengele cha unukuzi cha mitochondria 1 (TFAM), kipengele cha unukuzi cha NFE2-like BZIP (NFE2L2), protini 2-like gastrin (STOML2), kudhoofika kwa neva ya macho 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) na protini 1 inayohusiana na nguvu (DRP1) baada ya saa 24 za matibabu na PPA ya 3 mM na 5 mM. Tuliona 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 na p < 0.0001, mtawalia) na 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) matibabu ya PPA. (Mchoro 3a–c). Kupungua kwa usemi wa mRNA kulitegemea kipimo: usemi wa cMYC, NRF1 na TFAM ulipungua kwa mara 5.7, 2.6 na 1.9 kwa 3 mM, mtawalia, na kwa mara 11.2, 3 na 2.2 kwa 5 mM. Kwa upande mwingine, jeni kuu la redoksi ya biogenesis NFE2L2 halikubadilishwa kwa mkusanyiko wowote wa PPA, ingawa mwenendo sawa unaotegemea kipimo wa usemi uliopungua ulionekana (Mchoro 3d).
Pia tulichunguza usemi wa jeni za kitamaduni zinazohusika katika udhibiti wa mgawanyiko na muunganiko. STOML2 inadhaniwa kuhusika katika muunganiko, mitofaji na biogenesis, na usemi wake ulipunguzwa sana (p < 0.0001) kwa 3 mM (mabadiliko ya mara 2.4) na 5 mM (mabadiliko ya mara 2.8) PPA (Mchoro 1). 3d). Vile vile, usemi wa jeni la muunganiko wa OPA1 ulipungua kwa 3 mM (mabadiliko ya mara 1.6) na 5 mM (mabadiliko ya mara 1.9) PPA (p = 0.006 na p = 0.0024, mtawalia) (Mchoro 3f). Hata hivyo, hatukupata tofauti kubwa katika usemi wa jeni la muunganiko MFN1, MFN2 au jeni la muunganiko DRP1 chini ya mkazo wa PPA wa saa 24 (Mchoro 3g–i). Kwa kuongezea, tuligundua kuwa viwango vya protini nne za muunganiko na mgawanyiko (OPA1, MFN1, MFN2 na DRP1) havikubadilika chini ya hali sawa (Mchoro 4a–d). Ni muhimu kutambua kwamba data hizi zinaonyesha nukta moja kwa wakati na huenda zisionyeshe mabadiliko katika usemi wa protini au viwango vya shughuli wakati wa hatua za mwanzo za mkazo wa PPA. Hata hivyo, kupungua kwa kiasi kikubwa katika usemi wa cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, na OPA1 kunaonyesha uharibifu mkubwa wa unukuzi wa kimetaboliki ya mitochondrial, biogenesis, na mienendo. Kwa kuongezea, data hizi zinaangazia matumizi ya mbinu za upigaji picha ili kusoma moja kwa moja mabadiliko ya hali ya mwisho katika utendaji kazi wa mitochondrial.
Viwango vya protini ya vipengele vya muunganiko na mgawanyiko havikubadilika baada ya matibabu ya asidi ya propioniki (PPA). Seli za SH-SY5Y zilitibiwa na PPA ya 3 na 5 mM kwa saa 24. Viwango vya protini vilipimwa kwa uchambuzi wa blot ya Magharibi, na viwango vya usemi vilirekebishwa kuwa jumla ya protini. Usemi wa wastani wa protini na blot ya Magharibi inayowakilisha shabaha na jumla ya protini huonyeshwa. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Baa zinawakilisha wastani ± SEM, na data iliyoonyeshwa inawakilisha n = nakala 3 za kibiolojia. Ulinganisho mwingi (p < 0.05) ulifanywa kwa kutumia uchanganuzi wa njia moja wa tofauti na jaribio la Dunnett. Jeli ya asili na blot imeonyeshwa kwenye Mchoro S1.
Utendaji kazi wa mitochondria unahusishwa na magonjwa ya mifumo mingi kuanzia magonjwa ya kimetaboliki, moyo na mishipa na misuli hadi magonjwa ya neva1,10. Magonjwa mengi ya uharibifu wa neva na uharibifu wa neva yanahusishwa na utendakazi kazi wa mitochondria, na hivyo kuonyesha umuhimu wa organelle hizi katika maisha yote ya ubongo. Magonjwa haya ni pamoja na ugonjwa wa Parkinson, ugonjwa wa Alzheimer na ASD3,4,18. Hata hivyo, upatikanaji wa tishu za ubongo ili kusoma magonjwa haya ni mgumu, hasa katika kiwango cha kiufundi, na kufanya mifumo ya modeli za seli kuwa mbadala muhimu. Katika utafiti huu, tunatumia mfumo wa modeli za seli kwa kutumia seli za SH-SY5Y zilizotibiwa na PPA ili kufupisha utendakazi kazi wa mitochondria unaoonekana katika magonjwa ya neva, hasa matatizo ya wigo wa tawahudi. Kutumia modeli hii ya PPA kusoma mienendo ya mitochondria katika niuroni kunaweza kutoa ufahamu kuhusu etiolojia ya ASD.
Tulichunguza uwezekano wa kutumia TEM kutazama mabadiliko katika mofolojia ya mitochondria. Ni muhimu kutambua kwamba TEM lazima itumike kwa usahihi ili kuongeza ufanisi wake. Maandalizi ya vielelezo vya cryo huruhusu uhifadhi bora wa miundo ya niuroni kwa kurekebisha vipengele vya seli kwa wakati mmoja na kupunguza uundaji wa mabaki34. Sambamba na hili, tuliona kwamba seli za SH-SY5Y zinazofanana na niuroni zilikuwa na ogani ndogo za seli zisizo na madhara na mitochondria ndefu (Mchoro 1a). Hii inaangazia matumizi ya mbinu za maandalizi ya cryogenic kwa ajili ya kusoma mofolojia ya mitochondria katika mifano ya seli za niuroni. Ingawa vipimo vya kiasi ni muhimu kwa uchanganuzi wa lengo la data ya TEM, bado hakuna makubaliano kuhusu ni vigezo gani maalum vinavyopaswa kupimwa ili kuthibitisha mabadiliko ya mofolojia ya mitochondria. Kulingana na idadi kubwa ya tafiti ambazo zimechunguza mofolojia ya mitochondria kwa kiasi17,31,32, tulitengeneza bomba la uchambuzi wa picha za mitochondria otomatiki ambalo hupima vigezo nane vya mofolojia, yaani: eneo, eneo2, uwiano wa kipengele, mzunguko, duara, shahada , kipenyo cha Feret. na umbo la duara.
Miongoni mwao, PPA ilipunguza kwa kiasi kikubwa eneo la 2, eneo, mzunguko, na kipenyo cha Feret (Mchoro 1b–e). Hii ilionyesha kuwa mitochondria ikawa ndogo na yenye mviringo zaidi, ambayo inaendana na tafiti za awali zinazoonyesha kupungua kwa eneo la mitochondria baada ya saa 72 za msongo wa mitochondria unaosababishwa na PPA30. Sifa hizi za kimofolojia zinaweza kuonyesha mgawanyiko wa mitochondria, mchakato muhimu wa kutenga vipengele vilivyoharibika kutoka kwa mtandao wa mitochondria ili kukuza uharibifu wao kupitia mitophagy35,36,37. Kwa upande mwingine, kupungua kwa ukubwa wa wastani wa mitochondria kunaweza kuhusishwa na ongezeko la biogenesis, ambalo husababisha uundaji wa mitochondria ndogo changa. Kuongezeka kwa mgawanyiko au biogenesis kunawakilisha mwitikio wa fidia ili kudumisha mitosis dhidi ya msongo wa mitochondria. Hata hivyo, kupungua kwa ukuaji wa mitochondria, muunganiko ulioharibika, au hali nyingine haziwezi kutengwa.
Ingawa picha zenye ubora wa juu zilizoundwa na TEM huruhusu uamuzi wa sifa za kimofolojia katika kiwango cha mitochondria ya mtu binafsi, njia hii hutoa picha za pande mbili kwa wakati mmoja. Ili kusoma majibu ya nguvu kwa msongo wa kimetaboliki, tulipaka rangi mitochondria na TMRE na kutumia hadubini ya muda iliyopita kwa uchambuzi wa MEL, ambayo inaruhusu taswira ya 3D ya mabadiliko katika mtandao wa mitochondria kwa muda33,38. Tuliona mabadiliko madogo lakini muhimu katika mienendo ya mitochondria chini ya msongo wa PPA (Mchoro 2). Katika 3 mM, idadi ya matukio ya mgawanyiko iliongezeka kwa kiasi kikubwa, huku matukio ya mchanganyiko yakibaki sawa na katika udhibiti. Ongezeko la idadi ya matukio ya mgawanyiko na mchanganyiko lilionekana katika 5 mM PPA, lakini mabadiliko haya yalikuwa takriban sawia, ikidokeza kwamba kinetiki ya mgawanyiko na mchanganyiko hufikia usawa katika viwango vya juu zaidi (Mchoro 2b). Kiasi cha wastani cha mitochondria kilibaki bila kubadilika katika 3 na 5 mM PPA, ikionyesha kwamba uadilifu wa mtandao wa mitochondria ulihifadhiwa (Mchoro 2d). Hii inaonyesha uwezo wa mitandao mienendo ya mitochondrial kujibu msongo mdogo wa kimetaboliki ili kudumisha homeostasis kwa ufanisi bila kusababisha kugawanyika kwa mtandao. Katika 3 mM PPA, ongezeko la mgawanyiko linatosha kukuza mpito hadi usawa mpya, lakini urekebishaji wa kina zaidi wa kinetiki unahitajika katika kukabiliana na msongo unaosababishwa na viwango vya juu vya PPA.
Idadi ya mitochondria iliongezeka katika viwango vyote viwili vya msongo wa PPA, lakini wastani wa ujazo wa mitochondria haukubadilika sana (Mchoro 2c). Hii inaweza kuwa kutokana na ongezeko la biogenesis au mgawanyiko ulioongezeka; hata hivyo, bila kupungua kwa kiasi kikubwa cha wastani wa ujazo wa mitochondria, kuna uwezekano mkubwa kwamba biosynthesis huongezeka. Hata hivyo, data katika Mchoro 2 inaunga mkono kuwepo kwa mifumo miwili ya fidia: ongezeko la idadi ya matukio ya mgawanyiko, sambamba na ongezeko la mgawanyiko wa mitochondria, na ongezeko la idadi ya matukio, sambamba na biogenesis ya mitochondria. Hatimaye, fidia ya nguvu kwa msongo mdogo inaweza kujumuisha michakato ya wakati mmoja inayohusisha mgawanyiko, muunganiko, biogenesis, na mitofaji. Ingawa waandishi wa awali wameonyesha kuwa PPA huongeza mitoso30,39 na mitofaji29, tunatoa ushahidi wa kurekebisha mienendo ya mgawanyiko na muunganiko wa mitochondria ili kukabiliana na PPA. Data hizi zinathibitisha mabadiliko ya kimofolojia yaliyozingatiwa na TEM na kutoa ufahamu zaidi kuhusu mifumo inayohusiana na utendakazi mbaya wa mitochondria unaosababishwa na PPA.
Kwa sababu uchambuzi wa TEM wala MEL haukutoa ushahidi wa moja kwa moja wa mifumo ya udhibiti wa jeni inayosababisha mabadiliko ya kimofolojia yaliyoonekana, tulichunguza usemi wa RNA wa jeni zinazohusika katika metaboli ya mitochondria, biogenesis, na mienendo. Proto-onkojeni ya cMYC ni kipengele cha unukuzi kinachohusika katika udhibiti wa mitochondria, glikolisi, asidi amino na metaboli ya asidi ya mafuta40. Kwa kuongezea, cMYC inajulikana kudhibiti usemi wa jeni karibu 600 za mitochondria zinazohusika katika unukuzi wa mitochondria, tafsiri, na mkusanyiko tata, ikiwa ni pamoja na NRF1 na TFAM41. NRF1 na TFAM ni vidhibiti viwili vikuu vya mitosisi, vinavyofanya kazi chini ya PGC-1α ili kuamsha urudufishaji wa mtDNA. Njia hii inaamilishwa na ishara ya cAMP na AMPK na ni nyeti kwa matumizi ya nishati na msongo wa kimetaboliki. Pia tulichunguza NFE2L2, kidhibiti cha redoksi cha biogenesis ya mitochondria, ili kubaini kama athari za PPA zinaweza kusababishwa na msongo wa oksidi.
Ingawa usemi wa NFE2L2 haukubadilika, tulipata kupungua kwa usemi wa cMYC, NRF1 na TFAM kulingana na kipimo baada ya saa 24 za matibabu na 3 mM na 5 mM PPA (Mchoro 3a–c). Kupungua kwa usemi wa cMYC kumeripotiwa hapo awali kama jibu la msongo wa mitochondria42, na kinyume chake, kupungua kwa usemi wa cMYC kunaweza kusababisha hitilafu ya mitochondria kwa kurekebisha metaboli ya mitochondria, muunganisho wa mtandao, na upolarishaji wa utando43. Cha kufurahisha ni kwamba, cMYC pia inahusika katika udhibiti wa mgawanyiko wa mitochondria na muunganiko42,43 na inajulikana kuongeza fosforasi ya DRP1 na ujanibishaji wa mitochondria wakati wa mgawanyiko wa seli44, na pia kuingilia urekebishaji wa mofolojia wa mitochondria katika seli shina za neva45. Hakika, fibroblasti zenye upungufu wa cMYC zinaonyesha ukubwa mdogo wa mitochondria, unaoendana na mabadiliko yanayosababishwa na msongo wa PPA43. Data hizi zinaonyesha uhusiano wa kuvutia lakini bado haujaeleweka kati ya cMYC na mienendo ya mitochondria, na kutoa lengo la kuvutia kwa tafiti za baadaye za urekebishaji unaosababishwa na msongo wa PPA.
Kupungua kwa NRF1 na TFAM kunaendana na jukumu la cMYC kama kiamilishi muhimu cha unukuzi. Data hizi pia zinaendana na tafiti za awali katika seli za saratani ya utumbo mpana wa binadamu zinazoonyesha kuwa PPA ilipunguza usemi wa NRF1 mRNA katika saa 22, jambo ambalo lilihusishwa na kupungua kwa ATP na kuongezeka kwa ROS46. Waandishi hawa pia waliripoti kuwa usemi wa TFAM uliongezeka katika saa 8.5 lakini ulirudi katika viwango vya msingi katika saa 22. Kwa upande mwingine, Kim et al. (2019) walionyesha kuwa usemi wa TFAM mRNA ulipungua sana baada ya saa 4 za mkazo wa PPA katika seli za SH-SY5Y; hata hivyo, baada ya saa 72, usemi wa protini ya TFAM uliongezeka sana na nambari ya nakala ya mtDNA iliongezeka sana. Kwa hivyo, kupungua kwa idadi ya jeni za biogenesis ya mitochondria ambazo tuliona baada ya saa 24 hakuondoi uwezekano kwamba ongezeko la idadi ya mitochondria linahusishwa na uanzishaji wa biogenesis katika vipindi vya awali. Uchunguzi uliopita umeonyesha kuwa PPA huongeza kwa kiasi kikubwa mRNA ya PGC-1α na protini katika seli za SH-SY5Y kwa saa 4 dakika 30, huku asidi ya propionic ikiongeza biogenesis ya mitochondrial katika hepatocytes ya ndama kupitia PGC-1α kwa saa 12 dakika 39. Cha kufurahisha ni kwamba, PGC-1α si tu kidhibiti cha moja kwa moja cha unukuzi wa NRF1 na TFAM, lakini pia imeonyeshwa kudhibiti shughuli za MFN2 na DRP1 kwa kudhibiti mgawanyiko na muunganiko47. Kwa pamoja, hii inaangazia muunganiko wa karibu wa mifumo inayodhibiti majibu ya fidia ya mitochondrial yanayosababishwa na PPA. Zaidi ya hayo, data yetu inaonyesha ukiukwaji mkubwa wa udhibiti wa unukuzi wa biogenesis na kimetaboliki chini ya mkazo wa PPA.
Jeni za STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 na DRP1 ni miongoni mwa vidhibiti vikuu vya mgawanyiko, muunganiko na mienendo ya mitochondria37,48,49. Kuna jeni zingine nyingi zinazohusika katika mienendo ya mitochondria, hata hivyo, STOML2, OPA1 na MFN2 zimeonekana hapo awali kuwa na methili tofauti katika vikundi vya ASD,16 na tafiti kadhaa huru zimeripoti mabadiliko katika vipengele hivi vya unukuzi ili kukabiliana na msongo wa mitochondria50,51. 52. Usemi wa OPA1 na STOML2 ulipunguzwa kwa kiasi kikubwa kwa matibabu ya PPA ya 3 mM na 5 mM (Mchoro 3e, f). OPA1 ni mojawapo ya vidhibiti vya kitamaduni vya muunganiko wa mitochondria kupitia mwingiliano wa moja kwa moja na MFN1 na 2 na ina jukumu katika urekebishaji wa cristae na mofolojia ya mitochondria53. Jukumu sahihi la STOML2 katika mienendo ya mitochondria bado halijabainika, lakini ushahidi unaonyesha kwamba ina jukumu katika muunganiko wa mitochondria, biogenesis, na mitofaji.
STOML2 inahusika katika kudumisha muunganiko wa kupumua kwa mitochondria na uundaji wa minyororo ya kupumua54,55 na imeonyeshwa kubadilisha sana sifa za kimetaboliki za seli za saratani56. Uchunguzi umeonyesha kuwa STOML2 inakuza uwezo wa utando wa mitochondria na biogenesis kupitia mwingiliano na BAN na cardiolipin 55, 57, 58. Zaidi ya hayo, tafiti huru zimeonyesha kuwa mwingiliano kati ya STOML2 na PINK1 hudhibiti mitofaji59,60. Ikumbukwe kwamba, STOML2 imeripotiwa kuingiliana moja kwa moja na kuimarisha MFN2 na pia ina jukumu muhimu katika kuleta utulivu wa isofomu ndefu za OPA1 kwa kuzuia protease inayohusika na uharibifu wa OPA153,61,62. Kupungua kwa usemi wa STOML2 unaoonekana katika athari za PPA kunaweza kufanya protini hizi za muunganiko ziwe rahisi zaidi kuharibika kupitia njia zinazotegemea ubiquitin na proteasome48. Ingawa jukumu sahihi la STOML2 na OPA1 katika mwitikio wa nguvu kwa PPA halieleweki wazi, kupungua kwa usemi wa jeni hizi za muunganiko (Mchoro 3) kunaweza kuvuruga usawa kati ya mgawanyiko na muunganiko na kusababisha kupungua kwa ukubwa wa mitochondria (Mchoro 3). 1).
Kwa upande mwingine, usemi wa protini ya OPA1 ulibaki bila kubadilika baada ya saa 24, huku viwango vya mRNA na protini vya MFN1, MFN2 au DRP1 visivyobadilika sana baada ya matibabu ya PPA (Mchoro 3g-i, Mchoro 4). Hii inaweza kuonyesha kwamba hakuna mabadiliko katika udhibiti wa vipengele hivi vinavyohusika katika muunganiko na mgawanyiko wa mitochondria. Hata hivyo, ni muhimu kuzingatia kwamba kila moja ya jeni hizi nne pia inadhibitiwa na marekebisho ya baada ya unukuzi (PTM) ambayo hudhibiti shughuli za protini. OPA1 ina aina nane mbadala za splice ambazo zimepasuliwa kwa proteolytically katika mitochondria ili kutoa isoform mbili tofauti 63. Usawa kati ya isoforms ndefu na fupi hatimaye huamua jukumu la OPA1 katika muunganiko wa mitochondria na matengenezo ya mtandao wa mitochondria64. Shughuli ya DRP1 inadhibitiwa na fosforasi ya protini kinase II (CaMKII) inayotegemea kalsiamu/calmodulin, huku uharibifu wa DRP1 ukidhibitiwa na ubiquitination na SUMOylation65. Hatimaye, DRP1 na MFN1/2 zote ni GTPases, kwa hivyo shughuli zinaweza kuathiriwa na kiwango cha uzalishaji wa GTP katika mitochondria 66. Kwa hivyo, ingawa usemi wa protini hizi unabaki thabiti, hii inaweza isionyeshe shughuli au ujanibishaji wa protini ambao haujabadilika67,68. Hakika, repertoire zilizopo za protini za PTM mara nyingi hutumika kama safu ya kwanza ya ulinzi inayohusika na upatanishi wa majibu ya mfadhaiko mkali. Katika uwepo wa mfadhaiko wa wastani wa kimetaboliki katika mfumo wetu, kuna uwezekano kwamba PTM inakuza shughuli iliyoongezeka ya protini za muunganiko na mgawanyiko ili kurejesha uadilifu wa mitochondria vya kutosha bila kuhitaji uanzishaji wa ziada wa jeni hizi katika kiwango cha mRNA au protini.
Kwa pamoja, data hapo juu inaangazia udhibiti tata na unaotegemea wakati wa mofolojia ya mitochondrial na changamoto za kufafanua mifumo hii. Ili kusoma usemi wa jeni, ni muhimu kwanza kutambua jeni maalum zinazolengwa katika njia hiyo. Hata hivyo, data yetu inaonyesha kwamba jeni katika njia hiyo hiyo hazijibu kwa njia sawa kwa mkazo sawa. Kwa kweli, tafiti za awali zimeonyesha kuwa jeni tofauti katika njia hiyo hiyo zinaweza kuonyesha wasifu tofauti wa mwitikio wa muda30,46. Kwa kuongezea, kuna mifumo tata ya baada ya unukuzi ambayo huvuruga uhusiano kati ya unukuzi na utendaji kazi wa jeni. Uchunguzi wa proteomiki unaweza kutoa ufahamu kuhusu athari za PTM na utendaji kazi wa protini, lakini pia huleta changamoto ikiwa ni pamoja na mbinu za utoaji mdogo, uwiano wa juu wa ishara-kwa-kelele, na utatuzi duni.
Katika muktadha huu, kusoma mofolojia ya mitochondrial kwa kutumia TEM na MEL kuna uwezo mkubwa wa kushughulikia maswali ya msingi kuhusu uhusiano kati ya mienendo ya mitochondrial na utendaji kazi na jinsi hii inavyoathiri ugonjwa. Muhimu zaidi, TEM hutoa njia ya moja kwa moja ya kupima mofolojia ya mitochondrial kama mwisho unaolingana wa kutofanya kazi vizuri kwa mitochondrial na mienendo51. MEL pia hutoa njia ya moja kwa moja ya kuibua matukio ya mgawanyiko na muunganiko katika mazingira ya seli yenye pande tatu, kuruhusu upimaji wa urekebishaji mpya wa mitochondrial hata bila mabadiliko katika usemi wa jeni33. Hapa tunaangazia matumizi ya mbinu za upigaji picha wa mitochondrial katika magonjwa ya pili ya mitochondrial. Magonjwa haya kwa kawaida huonyeshwa na msongo wa kimetaboliki usio na sugu unaoonyeshwa na urekebishaji mdogo wa mitandao ya mitochondrial badala ya uharibifu mkubwa wa mitochondrial. Hata hivyo, fidia ya mitochondrial inayohitajika kudumisha mitochondrial chini ya msongo wa mawazo sugu ina matokeo makubwa ya utendaji kazi. Katika muktadha wa sayansi ya neva, uelewa bora wa mifumo hii ya fidia unaweza kutoa taarifa muhimu kuhusu neuropatholojia ya pleiotropic inayohusishwa na kutofanya kazi vizuri kwa mitochondrial.
Hatimaye, data yetu inaangazia manufaa ya mbinu za upigaji picha kwa ajili ya kuelewa matokeo ya utendaji kazi wa mwingiliano tata kati ya usemi wa jeni, marekebisho ya protini, na shughuli za protini zinazodhibiti mienendo ya mitochondria ya neva. Tulitumia PPA kuiga utendakazi mbaya wa mitochondria katika mfumo wa seli za neva ili kupata ufahamu kuhusu sehemu ya mitochondria ya ASD. Seli za SH-SY5Y zilizotibiwa na PPA zilionyesha mabadiliko katika umbo la mitochondria: mitochondria ikawa ndogo na ya mviringo, na cristae hazikubainishwa vizuri zilipozingatiwa na TEM. Uchambuzi wa MEL unaonyesha kuwa mabadiliko haya hutokea sambamba na ongezeko la matukio ya mgawanyiko na muunganiko ili kudumisha mtandao wa mitochondria katika kukabiliana na msongo mdogo wa kimetaboliki. Zaidi ya hayo, PPA inavuruga kwa kiasi kikubwa udhibiti wa unukuzi wa kimetaboliki ya mitochondria na homeostasis. Tulitambua cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, na OPA1 kama vidhibiti muhimu vya mitochondria vilivyovurugwa na msongo wa PPA na vinaweza kuchukua jukumu katika kupatanisha mabadiliko yanayosababishwa na PPA katika umbo na utendaji kazi wa mitochondria. Masomo ya baadaye yanahitajika ili kuainisha vyema mabadiliko ya muda yanayosababishwa na PPA katika usemi wa jeni na shughuli za protini, ujanibishaji, na marekebisho ya baada ya tafsiri. Data yetu inaangazia ugumu na utegemezi wa mifumo ya udhibiti inayopatanisha mwitikio wa msongo wa mitochondria na inaonyesha matumizi ya TEM na mbinu zingine za upigaji picha kwa tafiti za kiufundi zinazolenga zaidi.
Mstari wa seli wa SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) ulinunuliwa kutoka Sigma-Aldrich. Seli za SH-SY5Y zilikuzwa katika mchanganyiko wa virutubisho wa Dulbecco's medium/F-12 (DMEM/F-12) na L-glutamine (SC09411, ScienCell) katika chupa 25 cm2 zilizoongezewa seramu ya ng'ombe ya fetasi ya 20% (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) na 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) kwa joto la 37 °C, 5% CO2. Seli zilipandwa hadi kufikia 80% kwa kutumia 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), zikizungushwa kwa 300 g na kufunikwa kwa msongamano wa takriban seli 7 × 105/ml. Majaribio yote yalifanywa kwenye seli zisizotofautishwa za SH-SY5Y kati ya njia 19–22. PPA inatolewa kama NaP. Futa unga wa NaP (CAS No. 137-40-6, fomula ya kemikali C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) katika maji ya uvuguvugu ya MilliQ hadi mkusanyiko wa 1 M na uhifadhi kwenye 4 °C. Siku ya matibabu, punguza mchanganyiko huu na 1 M PPA hadi 3 mM na 5 mM PPA katika hali ya hewa isiyo na seramu (DMEM/F-12 na L-glutamine). Viwango vya matibabu kwa majaribio yote havikuwa PPA (0 mM, udhibiti), 3 mM, na 5 mM PPA. Majaribio yalifanywa katika angalau nakala tatu za kibiolojia.
Seli za SH-SY5Y zilipandwa kwenye chupa za sentimita 25 kwa kiwango cha seli 5.5 × 105/ml na kukuzwa kwa saa 24. Matibabu ya PPA yaliongezwa kwenye chupa kabla ya saa 24 za kuanguliwa. Kusanya chembe chembe za seli kwa kufuata itifaki za kawaida za ufugaji wa tishu za mamalia (zilizoelezwa hapo juu). Rudisha chembe chembe ya seli kwenye 100 µl 2.5% glutaraldehyde, 1 × PBS na uhifadhi kwenye 4 °C hadi usindikaji utakapokamilika. Seli za SH-SY5Y ziliwekwa kwa muda mfupi ili kuanguliwa kwenye seli na kuondoa 2.5% glutaraldehyde, 1 × mmumunyo wa PBS. Rudisha chembe ... Kisha halijoto iliongezwa hadi -80°C na mchanganyiko wa 1% osmium tetroxide na 0.1% glutaraldehyde uliongezwa. Sampuli zilihifadhiwa kwa -80°C kwa saa 24. Baada ya hapo, halijoto iliongezwa polepole hadi halijoto ya kawaida kwa siku kadhaa: kutoka -80°C hadi -50°C kwa saa 24, hadi -30°C kwa saa 24, hadi -10°C kwa saa 24 na hatimaye hadi halijoto ya kawaida.
Baada ya maandalizi ya cryogenic, sampuli zilijazwa resini na sehemu nyembamba sana (~100 nm) zilitengenezwa kwa kutumia Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems). Sehemu zilipakwa rangi ya 2% ya uranil asetati na risasi citrate. Sampuli zilizingatiwa kwa kutumia darubini ya elektroni ya upitishaji ya FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (zamani FEI), Eindhoven, Uholanzi) inayofanya kazi kwa 200 kV (kipitisha cha Lab6) na kamera ya Gatan CCD (Gatan, Uingereza) iliyo na kichujio cha nishati cha Tridiem.
Katika kila nakala ya kiufundi, angalau picha 24 za seli moja zilipatikana, kwa jumla ya picha 266. Picha zote zilichambuliwa kwa kutumia makro ya Eneo la Maslahi (ROI) na makro ya Mitochondria. Makro ya mitochondria inategemea mbinu zilizochapishwa17,31,32 na inaruhusu usindikaji wa kundi la TEM unaofanywa kwa nusu otomatiki huko Fiji/ImageJ69. Kwa kifupi: picha imegeuzwa na kugeuzwa kwa kutumia uondoaji wa usuli wa mpira unaoviringishwa (radius ya pikseli 60) na kichujio cha kupitisha bendi cha FFT (kwa kutumia mipaka ya juu na chini ya pikseli 60 na 8 mtawalia) na ukandamizaji wa mstari wima kwa uvumilivu wa mwelekeo wa 5%. Picha iliyosindikwa huwekwa kiotomatiki kwa kutumia algoriti ya juu ya entropy na barakoa ya binary huzalishwa. Maeneo ya picha yanayohusiana na ROI zilizochaguliwa kwa mikono katika picha mbichi za TEM yalitolewa, ikiainisha mitochondria na kutengwa kwa utando wa plasma na maeneo mengine yenye utofautishaji mkubwa. Kwa kila ROI iliyotolewa, chembe za binary zenye ukubwa wa zaidi ya pikseli 600 zilichambuliwa, na eneo la chembe, mzunguko, shoka kubwa na ndogo, kipenyo cha Feret, mviringo, na mviringo vilipimwa kwa kutumia vitendaji vya upimaji vilivyojengewa ndani vya Fiji/ImageJ. Kufuatia Merrill, Flippo, na Strack (2017), eneo la 2, uwiano wa kipengele cha chembe (uwiano mkubwa hadi mdogo wa mhimili), na kipengele cha umbo (FF) vilihesabiwa kutoka kwa data hizi, ambapo FF = eneo la mzunguko wa 2/4pi x. Ufafanuzi wa fomula ya parametric unaweza kupatikana katika Merrill, Flippo, na Strack (2017). Macro zilizotajwa zinapatikana kwenye GitHub (tazama Taarifa ya Upatikanaji wa Data). Kwa wastani, takriban chembe 5,600 zilichambuliwa kwa kila matibabu ya PPA, kwa jumla ya takriban chembe 17,000 (data haijaonyeshwa).
Seli za SH-SH5Y ziliwekwa katika vyombo vya uundaji vya vyumba 8 (ThermoFisher, #155411) ili kuruhusu kushikamana usiku kucha na kisha kufunikwa na TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) na Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Kupaka rangi. Picha zilipatikana kwa kutumia leza za nm 405 na 561 nam katika mazingira ya dakika 10, na picha mbichi zilipatikana kama z-stacks zenye mikrografu 10 za picha zenye hatua ya az ya 0.2 μm kati ya fremu za picha katika vipindi 12 vya muda vilivyofuata. Picha zilikusanywa kwa kutumia jukwaa la azimio kuu la Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Ujerumani) kwa kutumia lenzi ya LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Picha zilichambuliwa katika ImageJ kwa kutumia bomba lililoelezwa hapo awali na programu-jalizi ya ImageJ ili kupima matukio ya muunganiko na mgawanyiko, wastani wa idadi ya miundo ya mitochondria, na wastani wa ujazo wa mitochondria kwa kila seli33. Makro ya MEL yanapatikana kwenye GitHub (tazama Taarifa ya Upatikanaji wa Data).
Seli za SH-SY5Y zilikuzwa katika sahani za visima sita kwa msongamano wa seli 0.3 × 106/mL kwa saa 24 kabla ya matibabu. RNA ilitolewa kwa kutumia itifaki ya Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) ikiwa na marekebisho madogo: ongeza 300 μl ya bafa ya lysis ya RNA kwenye kila kisima kabla ya kuondolewa na lyse kila sampuli kama hatua ya mwisho na 30 μl ya elution ya DNase/RNase. -maji yasiyo na DNase. Sampuli zote zilikaguliwa kwa wingi na ubora kwa kutumia NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Jumla ya protini kutoka kwa lysates za seli ilipatikana kwa kutumia 200 μl ya bafa ya lysis ya RIPA, na mkusanyiko wa protini ulipimwa kwa kutumia jaribio la protini la Bradford70.
Usanisi wa cDNA ulifanyika kwa kutumia Kitengo cha Usanisi wa cDNA cha Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) kulingana na maagizo ya mtengenezaji pamoja na marekebisho kadhaa. cDNA ilitengenezwa katika athari za 20-μl kwa kutumia 0.7 hadi 1 μg ya jumla ya RNA. Vipimo vya awali vilichaguliwa kutoka kwa karatasi zilizochapishwa hapo awali 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Jedwali S1) na uchunguzi unaoambatana ulibuniwa kwa kutumia zana ya PrimerQuest kutoka Teknolojia za DNA Integrated. Jeni zote zinazovutia zilirekebishwa kuwa jeni la nyuklia la B2M. Usemi wa jeni wa STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC na OPA1 ulipimwa kwa RT-qPCR. Mchanganyiko mkuu ulijumuisha polimerasi ya LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), primers 10 za mbele na nyuma, cDNA, na maji ya kiwango cha PCR ili kutoa ujazo wa mwisho wa 10 μL kwa kila mmenyuko. Usemi wa jeni za mgawanyiko na mgawanyiko (DRP1, MFN1/2) ulipimwa kwa kutumia majaribio ya multiplex ya TaqMan. Mchanganyiko Mkuu wa Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) ulitumika kulingana na maagizo ya mtengenezaji pamoja na marekebisho madogo. Mchanganyiko mkuu wa multiplex RT-qPCR unajumuisha polimerasi ya LUNA Taq 1X, primers 10 za mbele na nyuma, probe ya 10 μM, cDNA, na maji ya kiwango cha PCR, na kusababisha ujazo wa mwisho wa 20 μL kwa kila mmenyuko. RT-qPCR ilifanywa kwa kutumia Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nambari ya serial: R0618110). Hali ya mzunguko imeonyeshwa katika Jedwali S1. Sampuli zote za cDNA ziliongezwa katika nakala tatu na mkunjo wa kawaida ulitengenezwa kwa kutumia mfululizo wa michanganyiko kumi. Vipimo vya nje katika sampuli tatu zenye kupotoka kwa kiwango cha mzunguko (Ct) >0.5 viliondolewa kwenye uchanganuzi ili kuhakikisha urejelezaji wa data30,72. Usemi wa jeni husika ulihesabiwa kwa kutumia mbinu ya 2-ΔΔCt79.
Sampuli za protini (60 μg) zilichanganywa na Laemmli load buffer kwa uwiano wa 2:1 na kuendeshwa kwa kutumia jeli ya protini isiyo na rangi ya 12% (Bio-Rad #1610184). Protini zilihamishiwa kwenye utando wa PVDF (polivinylidene floridi) (#170-84156, Bio-Rad) kwa kutumia mfumo wa Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Utando ulizuiwa na kuwekwa kwenye kingamwili za msingi zinazofaa (OPA1, MFN1, MFN2, na DRP1) (iliyopunguzwa 1:1000) kwa saa 48, ikifuatiwa na kuingizwa kwenye kingamwili za pili (1:10,000) kwa saa 1. Kisha utando ulipigwa picha kwa kutumia Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) na kurekodiwa kwa kutumia mfumo wa Bio-Rad ChemiDoc MP. Toleo la ImageLab 6.1 lilitumika kwa uchambuzi wa Western blot. Jeli na doa asilia vinaonyeshwa kwenye Mchoro S1. Taarifa za kingamwili zimetolewa katika Jedwali S2.
Seti za data zinawasilishwa kama kosa la wastani na la kawaida la wastani (SEM) wa angalau sampuli tatu huru. Seti za data zilijaribiwa kwa uhalisia kwa kutumia jaribio la Shapiro-Wilks (isipokuwa imeelezwa vinginevyo) kabla ya kuchukua usambazaji wa Gaussian na tofauti sawa za kawaida na kuendelea na uchambuzi. Mbali na kuchanganua seti ya data kwa kutumia Fisher's MEL LSD (p < 0.05), ANOVA ya njia moja (wastani wa matibabu dhidi ya udhibiti), na jaribio la kulinganisha nyingi la Dunnett ili kubaini umuhimu (p < 0.05). Thamani muhimu za p zinaonyeshwa kwenye grafu kama *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Uchambuzi na grafu zote za takwimu zilifanywa na kuzalishwa kwa kutumia GraphPad Prism 9.4.0.
Macro za Fiji/ImageJ za uchanganuzi wa picha za TEM zinapatikana hadharani kwenye GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Macro ya Mitochondrial Event Locator (MEL) inapatikana hadharani kwenye GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM na Vijaya A. Mitochondria: wadhibiti wakuu wa kimetaboliki, homeostasis, msongo wa mawazo, kuzeeka na epigenetics. Kiindonesia. Sayansi ya Biomedical. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Utendaji kazi wa mitochondria wenye sura nyingi katika skizofrenia, tata I kama lengo linalowezekana la kipatholojia. Schizophrenia. rasilimali. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. na Beal, MF Utendaji kazi wa Mitochondria katika ugonjwa wa Parkinson. J. Kemia ya neva. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG na Mehta V. Mitochondria iliyo na mkazo: shabaha za uvamizi katika ugonjwa wa Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF na Ferreira GK Mitochondria na ubongo: bioenergetics na zaidi. Sumu za neva. rasilimali. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitochondria ya Pleiotropic: athari ya mitochondria kwenye ukuaji wa neva na magonjwa. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. na Morais, VA Biogenesis ya Mitochondria katika niuroni: jinsi na wapi. kimataifa. J. Mohr. sayansi. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. na Zhao, J. Udhibiti wa mienendo ya mitochondria ya mamalia: fursa na changamoto. mbele. endokrini. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. na Slack, RS Mienendo ya mitochondria katika udhibiti wa neurogenesis: kutoka kwa ubongo unaokua hadi wa mtu mzima. maendeleo. mienendo. 247, 47–53 (2018).