Sasa *Anwani ya sasa: Cologne 50931, Ujerumani, Utafiti wa Kundi la Ubora wa Cologne kuhusu Mwitikio wa Msongo wa Mawazo ya Seli katika Magonjwa Yanayohusiana na Uzee (CECAD).
Uharibifu wa neva wa magonjwa ya mitochondrial unachukuliwa kuwa haubadiliki kwa sababu unyumbufu wa kimetaboliki wa niuroni ni mdogo, lakini athari ya uharibifu wa mitochondrial kwenye uhuru wa seli wa kimetaboliki ya niuroni mwilini haieleweki vizuri. Hapa, tunaanzisha proteome maalum ya niuroni za Purkinje zenye upungufu unaoendelea wa OXPHOS unaosababishwa na mienendo ya muunganiko wa mitochondrial iliyovurugika. Tuligundua kuwa uharibifu wa mitochondrial ulisababisha mabadiliko makubwa katika uwanja wa proteomics, ambayo hatimaye ilisababisha uanzishaji mfuatano wa programu sahihi za kimetaboliki kabla ya kifo cha seli. Bila kutarajia, tuligundua uanzishaji dhahiri wa pyruvate carboxylase (PCx) na vimeng'enya vingine vya kuzuia kuzeeka vinavyoongeza viunganishi vya mzunguko wa TCA. Kuzuiwa kwa PCx kulizidisha msongo wa oksidi na uharibifu wa neva, ikionyesha kuwa atherosclerosis ina athari ya kinga katika niuroni ambazo hazina OXPHOS. Kurejeshwa kwa muunganiko wa mitochondrial katika niuroni zilizoharibika kabisa hubadilisha sifa hizi za kimetaboliki, na hivyo kuzuia kifo cha seli. Matokeo yetu yanatambua njia ambazo hazikujulikana hapo awali ambazo hutoa ustahimilivu wa uharibifu wa mitochondrial na kuonyesha kwamba uharibifu wa neva unaweza kubadilishwa hata katika hatua za mwisho za ugonjwa.
Jukumu kuu la mitochondria katika kudumisha kimetaboliki ya nishati ya neva linasisitizwa na dalili nyingi za neva zinazohusiana na magonjwa ya mitochondria ya binadamu. Magonjwa mengi haya husababishwa na mabadiliko ya jeni ambayo hudhibiti usemi wa jeni ya mitochondria (1, 2) au uharibifu wa jeni unaohusiana na mienendo ya mitochondria, ambayo huathiri kwa njia isiyo ya moja kwa moja uthabiti wa DNA ya mitochondria (mtDNA) (3, 4). Kazi katika mifumo ya wanyama imeonyesha kuwa katika kukabiliana na utendakazi mbaya wa mitochondria katika tishu zinazozunguka, njia za kimetaboliki za kihafidhina (5-7) zinaweza kuamilishwa, ambayo hutoa taarifa muhimu kwa uelewa wa kina wa pathogenesis ya magonjwa haya magumu. Kwa upande mwingine, uelewa wetu wa mabadiliko ya kimetaboliki ya aina maalum za seli zinazosababishwa na kushindwa kwa jumla kwa uzalishaji wa adenosine triphosphate ya mitochondria ya ubongo (ATP) ni wa msingi (8), ukisisitiza hitaji la kutambua malengo ya matibabu ambayo yanaweza kutumika kuzuia au kuzuia magonjwa. Kuzuia kuzorota kwa neva (9). Ukosefu wa taarifa ni ukweli kwamba seli za neva zinachukuliwa sana kuwa na unyumbufu mdogo sana wa kimetaboliki ikilinganishwa na aina za seli za tishu zinazozunguka (10). Kwa kuzingatia kwamba seli hizi zina jukumu muhimu katika kuratibu usambazaji wa metaboli kwa niuroni ili kukuza upitishaji wa sinepsi na kujibu hali ya majeraha na magonjwa, uwezo wa kurekebisha umetaboli wa seli kwa hali ngumu za tishu za ubongo ni karibu mdogo kwa seli za glial (11-14). Kwa kuongezea, tofauti za seli za tishu za ubongo huzuia kwa kiasi kikubwa utafiti wa mabadiliko ya kimetaboliki yanayotokea katika vikundi vidogo maalum vya niuroni. Kwa hivyo, ni machache yanayojulikana kuhusu matokeo halisi ya seli na kimetaboliki ya kutofanya kazi vizuri kwa mitochondrial katika niuroni.
Ili kuelewa matokeo ya kimetaboliki ya kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria, tulitenga niuroni za Purkinje (PNs) katika hatua tofauti za kuzorota kwa neva kunakosababishwa na uharibifu wa muunganiko wa utando wa nje wa mitochondria (Mfn2). Ingawa mabadiliko ya Mfn2 kwa binadamu yanahusishwa na aina ya neuropathy ya hisia za gari ya kurithi inayojulikana kama Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), uharibifu wa masharti wa Mfn2 katika panya ni njia inayotambulika ya kuchochea kutofanya kazi vizuri kwa oksidation​​ Fosforilation (OXPHOS). Aina mbalimbali za niuroni (16-19) na phenotype inayosababisha kuzorota kwa neva huambatana na dalili za neva zinazoendelea, kama vile matatizo ya mwendo (18, 19) au serebela ataksia (16). Kwa kutumia mchanganyiko wa proteomics zisizo na lebo (LFQ), metabolomics, upigaji picha, na mbinu za virusi, tunaonyesha kuwa kuzorota kwa neva zinazoendelea husababisha kwa kiasi kikubwa usemi wa pyruvate carboxylase (PCx) na mambo mengine yanayohusika katika arteriosclerosis ya PNs katika mwili. Ili kuthibitisha umuhimu wa ugunduzi huu, tulipunguza haswa usemi wa PCx katika PN zenye upungufu wa Mfn2, na tukagundua kuwa operesheni hii ilizidisha msongo wa oksidi na kuharakisha uchakavu wa neva, hivyo kuthibitisha kwamba azoospermia husababisha kifo cha seli. Ubadilikaji wa kimetaboliki. Usemi mkali wa MFN2 unaweza kuokoa kabisa uchakavu wa mwisho wa PN wenye upungufu mkubwa wa OXPHOS, matumizi makubwa ya DNA ya mitochondrial, na mtandao wa mitochondrial unaoonekana kuvunjika, jambo ambalo linasisitiza zaidi kwamba aina hii ya uchakavu wa neva inaweza hata kupona katika hatua ya juu ya ugonjwa kabla ya kifo cha seli.
Ili kuibua mitochondria katika PN za Mfn2 zilizokatika, tulitumia aina ya panya inayoruhusu mitochondria inayotegemea Cre kulenga protini ya manjano ya fluorescent (YFP) (mtYFP) (20) Usemi wa Cre na kukagua umbo la mitochondria katika mwili. Tuligundua kuwa uharibifu wa jeni la Mfn2 katika PN ungesababisha mgawanyiko wa taratibu wa mtandao wa mitochondria (Mchoro S1A), na mabadiliko ya mapema zaidi yalipatikana katika umri wa wiki 3. Kwa upande mwingine, kuzorota kwa kiasi kikubwa kwa safu ya seli ya PN, kama inavyothibitishwa na upotevu wa kinga ya Calbindin, hakukuanza hadi wiki 12 za umri (Mchoro 1, A na B). Kutolingana kwa wakati kati ya mabadiliko ya mapema zaidi katika umbo la mitochondria na mwanzo unaoonekana wa kifo cha neva kulitufanya tuchunguze mabadiliko ya kimetaboliki yanayosababishwa na kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria kabla ya kifo cha seli. Tuliunda mkakati unaotegemea upangaji wa seli unaoamilishwa na fluorescence (FACS) ili kutenganisha PN inayoonyesha YFP (YFP+) (Mchoro 1C), na katika panya wa kudhibiti (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ambayo itajulikana kama CTRL (Mchoro S1B). Uboreshaji wa mkakati wa kuegemea kulingana na kiwango cha ishara ya YFP unaturuhusu kusafisha mwili wa YFP+ (YFPhigh) wa PN kutoka kwa zisizo za PN (YFPneg) (Mchoro S1B) au vipande vya aksoni/dendritic vya fluorescent (YFPlow; Mchoro S1D, kushoto), vilivyothibitishwa na darubini ya confocal (Mchoro S1D, kulia). Ili kuthibitisha utambulisho wa idadi ya watu walioainishwa, tulifanya proteomics za LFQ na kisha uchambuzi wa vipengele vikuu, na tukagundua kuwa kuna utengano wazi kati ya seli za YFPhigh na YFPneg (Mchoro S1C). Seli za YFPhigh zilionyesha utajiri halisi wa alama za PN zinazojulikana (yaani Calb1, Pcp2, Grid2 na Itpr3) (21, 22), lakini hakuna utajiri wa protini zinazoonyeshwa kwa kawaida katika niuroni au aina zingine za seli (Mchoro 1D)). Ulinganisho kati ya sampuli katika seli za YFPhigh zilizoainishwa zilizokusanywa katika majaribio huru ulionyesha mgawo wa uwiano> 0.9, ukionyesha urejelezaji mzuri kati ya nakala za kibiolojia (Mchoro S1E). Kwa muhtasari, data hizi zilithibitisha mpango wetu wa kutenganisha papo hapo na maalum ya PN inayowezekana. Kwa sababu mfumo wa kiendeshaji wa L7-cre unaotumika husababisha urejelezaji wa mosaic katika wiki ya kwanza baada ya kujifungua (23), tulianza kuwaua panya kutoka kwa CTRL na masharti (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kusanya niuroni. Baada ya urejelezaji kukamilika, huitwa Mfn2cKO katika umri wa wiki 4. Kama mwisho, tulichagua umri wa wiki 8 ambapo safu ya PN ilikuwa haijaharibika licha ya mgawanyiko dhahiri wa mitochondria (Mchoro 1B na Mchoro S1A). Kwa jumla, tulipima jumla ya protini 3013, ambazo karibu 22% zilitegemea maelezo ya MitoCarta 2.0 kulingana na proteome ya mitochondria kama mitochondria (Mchoro 1E) (Mchoro 1E) (24). Uchambuzi wa usemi wa jeni tofauti uliofanywa katika wiki ya 8 ulionyesha kuwa ni 10.5% tu ya protini zote zilikuwa na mabadiliko makubwa (Mchoro 1F na Mchoro S1F), ambapo protini 195 zilipunguzwa udhibiti na protini 120 ziliongezwa udhibiti (Mchoro 1F). Inafaa kuzingatia kwamba "uchambuzi wa njia bunifu" wa seti hii ya data unaonyesha kuwa jeni zilizoonyeshwa tofauti ni za seti iliyozuiliwa ya njia maalum za kimetaboliki (Mchoro 1G). Cha kufurahisha ni kwamba, ingawa kupungua kwa njia zinazohusiana na OXPHOS na uashiriaji wa kalsiamu kunathibitisha kuanzishwa kwa utendakazi mbaya wa mitochondria katika PN zenye upungufu wa muunganiko, kategoria zingine ambazo huhusisha zaidi umetaboli wa amino asidi zimeongezeka kwa kiasi kikubwa, ambayo inaendana na umetaboli unaotokea katika PN za mitochondria.
(A) Picha wakilishi za siri za sehemu za serebela za panya wa CTRL na Mfn2cKO zinazoonyesha upotevu unaoendelea wa PN (calbindin, kijivu); viini vilibadilishwa na DAPI. (B) Upimaji wa (A) (uchambuzi wa tofauti wa njia moja, ***P<0.001; n = miduara 4 hadi 6 kutoka kwa panya watatu). (C) Mtiririko wa kazi wa majaribio. (D) Usambazaji wa ramani ya joto ya alama maalum kwa Purkinje (juu) na aina zingine za seli (katikati). (E) Mchoro wa Venn unaoonyesha idadi ya protini za mitochondrial zilizotambuliwa katika PN iliyoainishwa. (F) Mchoro wa volkano wa protini zilizoonyeshwa tofauti katika niuroni za Mfn2cKO katika wiki 8 (thamani ya kukatwa ya umuhimu wa 1.3). (G) Uchambuzi wa njia ya ubunifu unaonyesha njia tano muhimu zaidi za urekebishaji (nyekundu) na urekebishaji wa chini (bluu) katika PN ya Mfn2cKO iliyoainishwa kama wiki 8. Kiwango cha wastani cha usemi wa kila protini iliyogunduliwa kinaonyeshwa. Ramani ya joto ya kijivu: thamani ya P iliyorekebishwa. ns, sio muhimu.
Data ya Proteomics ilionyesha kuwa usemi wa protini wa complexes I, III, na IV ulipungua polepole. Complexes I, III, na IV zote zilikuwa na subunits muhimu zilizosimbwa na mtDNA, huku complex II, ambayo ilikuwa na nucleus-coded pekee, haikuathiriwa kimsingi (Mchoro 2A na Mchoro S2A). . Sambamba na matokeo ya proteomics, immunohistochemistry ya sehemu za tishu za serebela ilionyesha kuwa kiwango cha subunit cha MTCO1 (mitochondrial saitokromu C oxidase subunit 1) cha complex IV katika PN kilipungua polepole (Mchoro 2B). Subunit iliyosimbwa na mtDNA Mtatp8 ilipunguzwa sana (Mchoro S2A), huku kiwango cha hali thabiti cha subunit ya ATP synthase iliyosimbwa na nyuklia kilibaki bila kubadilika, ambayo inaendana na complex inayojulikana ya ATP synthase subassembly F1 wakati usemi wa mtDNA unapokuwa thabiti. Uundaji ni thabiti. Kukatiza (7). Tathmini ya kiwango cha mtDNA katika PN za Mfn2cKO zilizopangwa kwa kutumia mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi wa wakati halisi (qPCR) ilithibitisha kupungua kwa taratibu kwa idadi ya nakala ya mtDNA. Ikilinganishwa na kundi la udhibiti, katika umri wa wiki 8, ni takriban 20% tu ya kiwango cha mtDNA kilichohifadhiwa (Mchoro 2C). Sambamba na matokeo haya, upakaji rangi wa hadubini ya confocal ya PN za Mfn2cKO ulitumika kugundua DNA, kuonyesha matumizi ya nyukleotidi za mitochondrial yanayotegemea wakati (Mchoro 2D). Tuligundua kuwa ni baadhi tu ya wagombea waliohusika katika uharibifu wa protini ya mitochondrial na mwitikio wa mfadhaiko walioongezeka, ikiwa ni pamoja na Lonp1, Afg3l2 na Clpx, na vipengele vya mkusanyiko tata wa OXPHOS. Hakuna mabadiliko makubwa katika viwango vya protini vinavyohusika katika apoptosis yaliyogunduliwa (Mchoro S2B). Vile vile, tuligundua kuwa mitochondria na njia za retikulamu za endoplasmic zinazohusika katika usafirishaji wa kalsiamu zina mabadiliko madogo tu (Mchoro S2C). Zaidi ya hayo, tathmini ya protini zinazohusiana na autophagy haikupata mabadiliko makubwa, ambayo yanaendana na uanzishaji unaoonekana wa autophagosomes zinazoonekana katika mwili kwa kutumia immunohistokemia na hadubini ya elektroni (Mchoro S3). Hata hivyo, utendakazi mbaya wa OXPHOS unaoendelea katika PNs unaambatana na mabadiliko dhahiri ya ultrastructural mitochondria. Makundi ya mitochondria yanaweza kuonekana katika miili ya seli na miti ya dendritic ya Mfn2cKO PNs wenye umri wa wiki 5 na 8, na muundo wa utando wa ndani umepitia mabadiliko makubwa (Mchoro S4, A na B). Sambamba na mabadiliko haya ya ultrastructural na kupungua kwa kiasi kikubwa kwa mtDNA, uchambuzi wa vipande vya serebela vya ubongo vyenye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) ulionyesha kuwa uwezo wa utando wa mitochondria katika Mfn2cKO PNs ulipungua kwa kiasi kikubwa (Mchoro S4C).
(A) Uchambuzi wa muda wa kiwango cha usemi wa mchanganyiko wa OXPHOS. Fikiria protini zenye P<0.05 tu katika wiki 8 (ANOVA ya njia mbili). Mstari wenye nukta: Hakuna marekebisho ikilinganishwa na CTRL. (B) Kushoto: Mfano wa sehemu ya serebela iliyoandikwa na kingamwili ya anti-MTCO1 (upau wa kipimo, 20 μm). Eneo linalokaliwa na miili ya seli ya Purkinje limefunikwa na manjano. Kulia: Upimaji wa viwango vya MTCO1 (uchambuzi wa tofauti ya njia moja; n = seli 7 hadi 20 zilizochambuliwa kutoka kwa panya watatu). (C) Uchambuzi wa qPCR wa nambari ya nakala ya mtDNA katika PN iliyopangwa (uchambuzi wa tofauti ya njia moja; n = panya 3 hadi 7). (D) Kushoto: Mfano wa kipande cha serebela kilichoandikwa na kingamwili ya anti-DNA (upau wa kipimo, 20 μm). Eneo linalokaliwa na miili ya seli ya Purkinje limefunikwa na manjano. Kulia: Upimaji wa vidonda vya mtDNA (uchambuzi wa tofauti ya njia moja; n = seli 5 hadi 9 kutoka kwa panya watatu). (E) Mfano wa sehemu ya serebela ya papo hapo inayoonyesha seli za mitoYFP + Purkinje (mshale) katika rekodi ya kibano cha kiraka cha seli nzima. (F) Upimaji wa mkunjo wa IV. (G) Rekodi wakilishi za sindano ya mkondo wa depolarizing katika seli za CTRL na Mfn2cKO Purkinje. Kielelezo cha juu: Mdundo wa kwanza uliosababisha AP. Kielelezo cha chini: Masafa ya juu ya AP. (H) Upimaji wa pembejeo za hiari za postsynaptic (sPSPs). Kielelezo cha kurekodi wakilishi na uwiano wake wa kukuza vimeonyeshwa katika (I). Uchambuzi wa njia moja wa tofauti ulichambuliwa n = seli 5 hadi 20 kutoka kwa panya watatu. Data imeonyeshwa kama wastani±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Vielelezo wakilishi vya AP ya hiari vilivyorekodiwa kwa kutumia hali ya kibano cha kiraka kilichotobolewa. Kielelezo cha juu: Masafa ya juu ya AP. Kielelezo cha chini: ukuzaji wa AP moja. (K) Pima masafa ya wastani na ya juu ya AP kulingana na (J). Jaribio la Mann-Whitney; n = seli 5 zilichambuliwa kutoka kwa panya wanne. Data huonyeshwa kama wastani±SEM; si muhimu.
Uharibifu dhahiri wa OXPHOS uligunduliwa katika Mfn2cKO PN ya wiki 8, ikionyesha kuwa utendaji kazi wa kisaikolojia wa niuroni si wa kawaida sana. Kwa hivyo, tulichambua sifa za umeme tulivu za niuroni zenye upungufu wa OXPHOS katika wiki 4 hadi 5 na wiki 7 hadi 8 kwa kufanya rekodi za kibano cha kiraka cha seli nzima katika vipande vya serebela kali (Mchoro 2E). Bila kutarajia, wastani wa uwezo wa utando wa kupumzika na upinzani wa ingizo wa niuroni za Mfn2cKO zilikuwa sawa na udhibiti, ingawa kulikuwa na tofauti ndogo kati ya seli (Jedwali 1). Vile vile, katika umri wa wiki 4 hadi 5, hakuna mabadiliko makubwa katika uhusiano wa volteji ya mkondo (mkondo wa IV) yaliyopatikana (Mchoro 2F). Hata hivyo, hakuna niuroni za Mfn2cKO zenye umri wa wiki 7 hadi 8 zilizonusurika utaratibu wa IV (hatua ya hyperpolarisation), ikionyesha kuwa kuna unyeti wazi kwa uwezo wa hyperpolarisation katika hatua hii ya mwisho. Kwa upande mwingine, katika niuroni za Mfn2cKO, mikondo ya depolarizing ambayo husababisha kutokwa kwa uwezo wa kutenda unaorudiwa (AP) huvumiliwa vyema, ikionyesha kwamba mifumo yao ya jumla ya kutokwa si tofauti sana na ile ya niuroni za udhibiti za wiki 8 (Jedwali 1 na Mchoro 2G). Vile vile, masafa na ukubwa wa mikondo ya postsynaptic ya hiari (sPSCs) ulilinganishwa na ule wa kundi la udhibiti, na masafa ya matukio yaliongezeka kutoka wiki 4 hadi wiki 5 hadi wiki 7 hadi wiki 8 na ongezeko sawa (Mchoro 2, H na I). ​​Kipindi cha kukomaa kwa sinepsi katika PN (25). Matokeo sawa yalipatikana baada ya viraka vya PN vilivyotobolewa. Usanidi huu huzuia fidia inayowezekana ya kasoro za ATP za seli, kama inavyoweza kutokea katika kurekodi kibano cha kiraka cha seli nzima. Hasa, uwezo wa utando wa kupumzika na masafa ya kurusha kwa hiari ya niuroni za Mfn2cKO hayakuathiriwa (Mchoro 2, J na K). Kwa muhtasari, matokeo haya yanaonyesha kwamba PN zenye hitilafu dhahiri ya OXPHOS zinaweza kukabiliana vyema na mifumo ya utoaji wa marudio ya juu, ikionyesha kwamba kuna utaratibu wa fidia unaoziruhusu kudumisha majibu ya kielektroniki ya karibu ya kawaida.
Data huonyeshwa kama wastani ± SEM (uchambuzi wa tofauti wa njia moja, jaribio la kulinganisha nyingi la Holm-Sidak; *P<0.05). Nambari ya kitengo imeonyeshwa na mabano.
Tulianza kuchunguza kama kategoria yoyote katika seti ya data ya proteomics (Mchoro 1G) inajumuisha njia zinazoweza kukabiliana na upungufu mkubwa wa OXPHOS, na hivyo kuelezea kwa nini PN iliyoathiriwa inaweza kudumisha elektrofiziolojia ya karibu kawaida (Mchoro 2, E hadi K). Uchambuzi wa proteomics ulionyesha kuwa vimeng'enya vinavyohusika katika ukataboli wa asidi amino za mnyororo wenye matawi (BCAA) viliboreshwa kwa kiasi kikubwa (Mchoro 3A na Mchoro S5A), na bidhaa ya mwisho asetili-CoA (CoA) au succinyl CoA inaweza kuongeza trikaboksilati katika mzunguko wa arteriosclerosis Acid (TCA). Tuligundua kuwa kiwango cha BCAA transaminase 1 (BCAT1) na BCAT2 zote ziliongezeka. Zinachochea hatua ya kwanza ya ukataboli wa BCAA kwa kutoa glutamate kutoka kwa α-ketoglutarati (26). Vitengo vidogo vyote vinavyounda mchanganyiko wa keto acid dehydrogenase (BCKD) vimeongezwa (mchanganyiko huu huchochea uondoaji wa kaboksili unaofuata na usioweza kurekebishwa wa mifupa ya kaboni ya BCAA inayotokana) (Mchoro 3A na Mchoro S5A). Hata hivyo, hakuna mabadiliko dhahiri katika BCAA yenyewe yaliyopatikana katika PN iliyopangwa, ambayo inaweza kuwa kutokana na kuongezeka kwa ufyonzaji wa seli wa asidi hizi muhimu za amino au matumizi ya vyanzo vingine (sukari au asidi lactic) ili kuongeza mzunguko wa TCA (Mchoro S5B). PN zisizo na OXPHOS pia zilionyesha kuongezeka kwa shughuli za utengano wa glutamine na transamination katika umri wa wiki 8, ambayo inaweza kuonyeshwa na kuongezeka kwa udhibiti wa vimeng'enya vya mitochondrial glutaminase (GLS) na glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Mchoro 3, A na C). Inafaa kuzingatia kwamba ongezeko la GLS ni mdogo kwa isoform glutaminase C (GLS-GAC) iliyounganishwa (mabadiliko ya Mfn2cKO/CTRL ni takriban mara 4.5, P = 0.05), na ongezeko lake maalum katika tishu za saratani. Inaweza kusaidia bioenergy ya mitochondrial. (27).
(A) Ramani ya joto inaonyesha mabadiliko ya mkunjo katika kiwango cha protini kwa njia maalum katika wiki 8. (B) Mfano wa kipande cha serebela kilichoandikwa na antibody ya anti-PCx (upau wa kipimo, 20 μm). Mshale wa manjano unaelekeza kwenye mwili wa seli ya Purkinje. (C) Uchambuzi wa usemi wa protini ya mwendo wa wakati uliotambuliwa kama mgombea muhimu wa atherosclerosis (jaribio la t nyingi, *FDR <5%; n = panya 3-5). (D) Hapo juu: Mchoro wa kimchoro unaoonyesha njia tofauti za kuingiza kaboni iliyoandikwa iliyomo kwenye kifuatiliaji cha pyruvate cha [1-13C] (yaani, kupitia PDH au njia ya trans-arterial). Chini: Chati ya violin inaonyesha asilimia ya kaboni yenye lebo moja (M1) iliyobadilishwa kuwa asidi ya aspartiki, asidi ya citric na asidi ya malic baada ya kuweka lebo vipande vya serebela kali na [1-13C]pyruvate (jaribio la t lililounganishwa; ** P <0.01). (E) Uchambuzi kamili wa historia ya wakati wa njia iliyoonyeshwa. Fikiria protini zenye P<0.05 tu katika wiki 8. Mstari uliopigwa mstari: hakuna thamani ya marekebisho (uchambuzi wa tofauti wa pande mbili; * P <0.05; *** P <0.001). Data huonyeshwa kama wastani±SEM.
Katika uchanganuzi wetu, ukataboli wa BCAA umekuwa mojawapo ya njia muhimu za uboreshaji wa udhibiti. Ukweli huu unaonyesha kwa nguvu kwamba kiasi cha uingizaji hewa kinachoingia kwenye mzunguko wa TCA kinaweza kubadilishwa katika PN isiyo na OXPHOS. Hii inaweza kuwakilisha aina kuu ya uunganishaji upya wa metabolic wa neva, ambayo inaweza kuwa na athari ya moja kwa moja kwenye fiziolojia ya neva na kuishi wakati wa kudumisha hitilafu kali ya OXPHOS. Sambamba na dhana hii, tuligundua kuwa kimeng'enya kikuu cha anti-atherosclerotic PCx kimeimarishwa (Mfn2cKO/CTRL hubadilika takriban mara 1.5; Mchoro 3A), ambacho huchochea ubadilishaji wa pyruvate kuwa oxaloacetate (28), ambayo inaaminika kuwa katika tishu za ubongo. Usemi wa ndani umepunguzwa kwa astrocytes (29, 30). Sambamba na matokeo ya proteomics, hadubini ya confocal ilionyesha kuwa usemi wa PCx uliongezeka haswa na kwa kiasi kikubwa katika PN zenye upungufu wa OXPHOS, huku reactivity ya PCx ikipunguzwa zaidi kwa seli za glial za Bergmann za udhibiti zilizo karibu (Mchoro 3B). Ili kujaribu utendaji kazi wa ongezeko la PCx, tulitibu vipande vya serebela vya papo hapo kwa kutumia kifuatiliaji cha [1-13C]pyruvate. Wakati pyruvate ilipooksidishwa na pyruvate dehydrogenase (PDH), lebo yake ya isotopu ilitoweka, Lakini imejumuishwa katika viunganishi vya mzunguko wa TCA wakati pyruvate inapochanganuliwa na athari za mishipa ya damu (Mchoro 3D). Ili kuunga mkono data yetu ya proteomics, tuliona idadi kubwa ya alama kutoka kwa kifuatiliaji hiki katika asidi ya aspartiki ya vipande vya Mfn2cKO, huku asidi ya citric na asidi ya malic pia vikiwa na mwelekeo wa wastani, ingawa si muhimu (Mchoro 3D).
Katika niuroni za dopamini za panya wa MitoPark zenye hitilafu ya mitochondrial inayosababishwa na niuroni za dopamini zinazoharibu hasa jeni la nukuu ya mitochondrial A (Tfam) (Mchoro S6B), usemi wa PCx pia uliongezeka kwa kiasi kikubwa (31), ikionyesha kuwa asidi ya asetoni arteriosclerosis. Kutokea kwa ugonjwa huo kunadhibitiwa wakati wa hitilafu ya OXPHOS ya neva mwilini. Inafaa kuzingatia kwamba imegundulika kuwa vimeng'enya vya kipekee (32-34) ambavyo vinaweza kuonyeshwa katika niuroni ambazo zinaweza kuhusishwa na arteriosclerosis vimeongezeka kwa kiasi kikubwa katika PN ambazo hazipo katika OXPHOS, kama vile propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA hubadilisha propionyl-CoA kuwa succinyl-CoA na kimeng'enya cha malic cha mitochondrial 3 (ME3), ambacho jukumu lake kuu ni kurejesha pyruvate kutoka kwa malate (Mchoro 3, A na C) (33, 35). Zaidi ya hayo, tulipata ongezeko kubwa la kimeng'enya cha Pdk3, ambacho hutengeneza fosforasi na hivyo kuzima PDH (36), huku hakuna mabadiliko yaliyogunduliwa katika kimeng'enya cha Pdp1 kinachoamilisha PDH au kimeng'enya cha PDH chenyewe (Mchoro 3A). Mara kwa mara, katika Mern2cKO PNs, fosforasi ya kitengo kidogo cha α1 α (PDHE1α) cha sehemu ya pyruvate dehydrogenase E1 ya kimeng'enya cha PDH katika Ser293 (inayojulikana kuzuia shughuli ya kimeng'enya cha PDH) iliimarishwa (Mchoro S6C) (Mchoro S6C). Pyruvate haina ufikiaji wa mishipa.
Hatimaye, tuligundua kwamba njia bora ya usanisi wa serine na glycine, mzunguko wa folate ya mitochondrial (1C) unaohusiana na usanisi wa proline (Mchoro 1G na Mchoro S5C) zote zimeimarishwa kwa kiasi kikubwa, kulingana na ripoti, wakati wa mchakato wa uanzishaji. Tishu zinazozunguka huamilishwa na hitilafu ya mitochondrial (5-7). Uchambuzi wa siri unaounga mkono data hizi za proteomics ulionyesha kuwa katika PN huku OXPHOS ikikosekana, vipande vya serebela vya panya wa wiki 8 vilifanyiwa serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), kimeng'enya muhimu cha mzunguko wa folate ya mitochondrial. Mwitikio mkubwa wa kinga (Mchoro S5D). Katika vipande 13 vya serebela vya CU-glucose-incubated, majaribio ya ufuatiliaji wa kimetaboliki yalithibitisha zaidi kuongezeka kwa usanisi wa serine na proline, ikionyesha kwamba mtiririko wa isoforms za kaboni ndani ya serine na proline uliongezeka (Mchoro S5E). Kwa kuwa athari zinazochochewa na GLS na GPT2 zina jukumu la usanisi wa glutamate kutoka glutamine na ubadilishanaji kati ya glutamate na α-ketoglutarate, ongezeko lao linaonyesha kuwa niuroni zenye upungufu wa OXPHOS zina mahitaji yaliyoongezeka ya glutamate, Hii ​​inaweza kulenga kudumisha ongezeko la usanisi wa proline (Mchoro S5C). Tofauti na mabadiliko haya, uchambuzi wa proteomiki wa astrosaiti za serebela kutoka kwa panya maalum wa Mfn2cKO wa PN ulionyesha kuwa njia hizi (ikiwa ni pamoja na antiperoxidases zote) hazikubadilika sana katika usemi, hivyo kuonyesha Uelekezaji huu wa kimetaboliki ni wa kuchagua PN iliyoharibika (Mchoro S6, D hadi G).
Kwa muhtasari, uchambuzi huu ulifunua mifumo tofauti sana ya uanzishaji wa muda wa njia maalum za kimetaboliki katika PN. Ingawa utendaji usio wa kawaida wa mitochondria ya neva unaweza kusababisha atherosclerosis mapema na urekebishaji wa 1C (Mchoro 3E na Mchoro S5C), na hata mabadiliko yanayotabirika katika usemi wa michanganyiko ya I na IV, mabadiliko katika usanisi wa serine de novo ni pekee. Ilionekana wazi tu katika hatua za mwisho. Utendakazi mbaya wa OXPHOS (Mchoro 3E na Mchoro S5C). Matokeo haya yanafafanua mchakato mfuatano ambapo mitochondria inayosababishwa na mkazo (mzunguko wa 1C) na saitoplazimu (biosynthesis ya serine) huitikia sanjari na ongezeko la atherosclerosis katika mzunguko wa TCA ili kuunda upya kimetaboliki ya neva.
PN za OXPHOS zenye upungufu wa wiki 8 zinaweza kudumisha shughuli za msisimko wa masafa ya juu na kupitia muunganisho mkubwa wa kimetaboliki ili kufidia hitilafu ya mitochondria. Ugunduzi huu unaibua uwezekano wa kuvutia kwamba hata wakati huu, seli hizi zinaweza pia kupokea uingiliaji kati wa matibabu ili kuchelewesha au kuzuia kuzorota kwa neva. Marehemu. Tulitatua uwezekano huu kupitia uingiliaji kati mbili huru. Katika njia ya kwanza, tulibuni vekta ya virusi vinavyohusiana na adeno (AAV) inayotegemea Cre ili MFN2 iweze kuonyeshwa kwa hiari katika PN zenye upungufu wa OXPHOS katika mwili (Mchoro S7A). Usimbaji wa AAV MFN2 na jeni la mwandishi wa fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) zilithibitishwa katika tamaduni za niuroni za msingi katika vitro, ambazo zilisababisha MFN2 kuonyeshwa kwa njia inayotegemea Cre na kuokoa mofolojia ya mitochondria, na hivyo kuzuia mabadiliko ya neva katika niuroni za Mfn2cKO (Mchoro S7, B, D na E). Kisha, tulifanya majaribio ya ndani ya mwili ili kupeleka Mfn2-AAV ya wiki 8 kwa njia ya stereotactic kwenye gamba la serebela la Mfn2cKO na panya wa kudhibiti, na kuchanganua panya wa wiki 12 (Mchoro 4A). Panya wa Mfn2cKO waliotibiwa walikufa (Mchoro 1, A na B) (16). Uhamishaji wa virusi ndani ya mwili ulisababisha usemi wa PN katika baadhi ya duru za serebela (Mchoro S7, G na H). Kudungwa kwa AAV ya kudhibiti inayoonyesha mCherry pekee (Ctrl-AAV) hakukuwa na athari kubwa kwa kiwango cha kuzorota kwa neva katika wanyama wa Mfn2cKO. Kwa upande mwingine, uchanganuzi wa Mfn2cKO zilizopitishwa na Mfn2-AAV ulionyesha athari kubwa ya kinga ya safu ya seli ya PN (Mchoro 4, B na C). Hasa, msongamano wa niuroni unaonekana kutotofautiana na wanyama wa kudhibiti (Mchoro 4, B na C, na Mchoro S7, H na I). Usemi wa MFN1 lakini si MFN2 una ufanisi sawa katika kuokoa kifo cha neva (Mchoro 4C na Mchoro S7, C na F), ambayo inaonyesha kwamba usemi wa MFN1 ya nje ya kizazi unaweza kuongeza kwa ufanisi ukosefu wa MFN2. Uchambuzi zaidi katika kiwango kimoja cha PN ulionyesha kuwa Mfn2-AAV kwa kiasi kikubwa iliokoa muundo wa juu wa mitochondria, ikarekebisha viwango vya mtDNA, na ikabadilisha usemi wa juu wa alama ya anti-angiogenesis PCx ​​(Mchoro 4, C hadi E). Ukaguzi wa macho wa panya waliookolewa wa Mfn2cKO wakiwa katika hali ya kupumzika ulionyesha kuwa mkao wao na dalili za mwendo (mwendo wa S1 hadi S3) uliboreshwa. Kwa kumalizia, majaribio haya yanaonyesha kuwa kuchelewa kuingizwa tena kwa MFN2 kwenye PN zenye upungufu mkubwa wa OXPHOS kunatosha kurekebisha matumizi ya mtDNA na kusababisha atherosclerosis, na hivyo kuzuia kuzorota kwa akzoni na kifo cha neva mwilini.
(A) Mpango unaoonyesha ratiba ya majaribio ya kuingiza AAV encoding MFN2 wakati njia iliyoonyeshwa ya kimetaboliki inapoamilishwa. (B) Picha wakilishi za siri za vipande vya serebela vya wiki 12 vilivyopitishwa katika wiki 8 katika panya wa Mfn2cKO na kuwekwa lebo ya anti-Calbindin antibody. Kulia: Upanaji wa nyuzi za aksoni. Kipimo cha zoom ya aksoni ni 450 na 75 μm. (C) Kushoto: Upimaji wa msongamano wa seli ya Purkinje katika kitanzi cha upitishaji cha AAV (AAV+) (uchambuzi wa njia moja wa tofauti; n = panya 3). Kulia: uchambuzi wa umakini wa mtDNA katika PN iliyopitishwa katika wiki ya 12 (jaribio la t lisilounganishwa; n = seli 6 kutoka kwa panya watatu). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrografu wakilishi za elektroni za upitishaji za PN za sehemu za serebela za Mfn2cKO zilizopitishwa na vekta za virusi zilizoonyeshwa. Barakoa ya waridi inaonyesha eneo linalokaliwa na dendriti, na mraba wenye nukta za manjano unaonyesha zoom iliyotolewa upande wa kulia; n inawakilisha kiini. Upau wa kipimo, 1μm. (E) inaonyesha mfano wa madoa ya PCx katika PN iliyopitishwa baada ya wiki 12. Upau wa kipimo, 20μm. OE, mwonekano kupita kiasi; FC, mabadiliko ya mkunjo.
Hatimaye, tulichunguza umuhimu wa uhai wa seli zinazosababishwa na peroxidase katika PN ambazo zimepitia hitilafu ya OXPHOS. Tulizalisha mCherry inayosimba AAV-shRNA (RNA fupi ya nywele) ikilenga hasa PCx mRNA ya panya (AAV-shPCx), na kuingiza virusi au udhibiti wake uliochanganyika (AAV-scr) kwenye serebela ya panya wa Mfn2cKO. Sindano hiyo ilifanywa katika wiki ya nne ya umri (Mchoro 5A) ili kufikia PCx iliyoanguka kwa ufanisi wakati wa kipindi ambacho usemi wa PCx uliongezeka (Mchoro 3C) na safu ya seli ya PN ilikuwa bado haijaharibika (Mchoro 1A). Ni muhimu kuzingatia kwamba kuangusha PCx (Mchoro S8A) husababisha kasi kubwa ya kifo cha PN, ambayo ni mdogo kwa pete iliyoambukizwa (Mchoro 5, B na C). Ili kuelewa utaratibu wa athari za kimetaboliki zinazosababishwa na uboreshaji wa udhibiti wa PCx, tulisoma hali ya redoksi ya PN baada ya PCx ​​knockdown na biosensor ya macho inayosimamiwa na AAV Grx1-roGFP2 zilionyeshwa kwa wakati mmoja (Mchoro S8, B hadi D) ili kutathmini mabadiliko ya jamaa ya uwezo wa redoksi ya peptidi (38). Kisha, tulifanya hadubini ya upigaji picha wa maisha ya fluorescence mbili (FLIM) katika vipande vya ubongo vya Mfn2cKO ya wiki 7 au wanyama wengine wa kudhibiti ili kugundua mabadiliko yanayowezekana katika hali ya redoksi ya saitoplazimu baada ya kuthibitisha hali za FLIM (Mchoro S8, E hadi G). Uchambuzi ulionyesha ongezeko kubwa la hali ya oksidi ya PN moja ya Mfn2cKO isiyo na usemi wa PCx, ambayo ni tofauti na niuroni za kudhibiti au PN za Mfn2cKO zinazoonyesha shRNA iliyokunwa pekee (Mchoro 5, D na E). Wakati usemi wa PCx ulipopunguzwa, asilimia ya Mfn2cKO PNs zinazoonyesha hali ya oksidi nyingi iliongezeka kwa zaidi ya mara tatu (Mchoro 5E), ikionyesha kwamba urekebishaji wa PCx ulidumisha uwezo wa redoksi wa niuroni zilizoharibika.
(A) Mpango unaoonyesha ratiba ya majaribio ya kuingiza AAV encoding shPCx wakati njia iliyoonyeshwa ya kimetaboliki inapoamilishwa. (B) Picha wakilishi za siri za sehemu za serebela za wiki 8 katika panya wa Mfn2cKO zilizobadilishwa na kuwekwa lebo ya anti-calcineurin katika wiki 4. Upau wa kipimo, 450μm. (C) Upimaji wa msongamano wa seli ya Purkinje katika vitanzi vilivyobadilishwa AAV (uchambuzi wa tofauti wa njia moja; n = panya 3 hadi 4). Data zinaonyeshwa kama wastani±SEM; ***P<0.001. (D) Picha wakilishi ya FLIM inaonyesha wastani wa muda wa maisha wa sensa ya redoksi ya glutathione ya wiki 7 inayoonyesha PN Grx1-roGFP2 chini ya hali maalum za majaribio. Uwiano wa LUT (jedwali la kuangalia): muda wa kuishi (katika picoseconds). Upau wa kipimo, 25μm. (E) Histogramu inaonyesha usambazaji wa thamani za maisha ya Grx1-roGFP2 kutoka (D) (n=seli 158 hadi 368 katika panya wawili chini ya kila hali). Chati ya pai juu ya kila histogramu: inaonyesha idadi ya seli zenye thamani za maisha ya muda mrefu zaidi (nyekundu, zilizooksidishwa) au fupi zaidi (bluu, zilizopunguzwa), ambazo zinazidi SD 1 ya thamani ya wastani ya maisha ya muda katika CTRL-AAV-scr. (F) Mfano uliopendekezwa unaonyesha athari ya kinga ya kuongezeka kwa PCx ya neva.
Kwa ujumla, data tunayotoa hapa inaonyesha kwamba usemi upya wa MFN2 unaweza kuokoa kabisa PN iliyoendelea yenye upungufu mkubwa wa OXPHOS, kupungua kwa mtDNA kali, na umbo lisilo la kawaida sana linalofanana na ista, na hivyo kutoa maendeleo endelevu hata katika magonjwa yaliyoendelea. Uharibifu wa neva hutoa ushahidi unaoweza kurekebishwa wa hatua kabla ya kifo cha seli. Kiwango hiki cha unyumbufu wa kimetaboliki kinasisitizwa zaidi na uwezo wa niuroni kusababisha atherosclerosis (uunganishaji upya wa mzunguko wa TCA), ambao huzuia usemi wa PCx katika PN zisizo na OXPHOS na huongeza kifo cha seli, na hivyo kuchukua jukumu la kinga (Mchoro 5F).
Katika utafiti huu, tulitoa ushahidi kwamba mwitikio wa PNs kwa utendaji kazi wa OXPHOS ni kuungana polepole na atherosclerosis ya mzunguko wa TCA kupitia njia tofauti ya uanzishaji inayoamilishwa na programu za kimetaboliki. Tulithibitisha uchanganuzi wa proteomiki kwa njia nyingi zinazosaidiana na kufichua kwamba zinapokabiliwa na utendaji kazi mbaya wa mitochondria, niuroni zina aina isiyojulikana ya unyumbufu wa kimetaboliki. Kwa mshangao wetu, mchakato mzima wa kuunganisha waya upya si lazima uonyeshe hali ya mwisho ya kimetaboliki inayoambatana na kuzorota kwa neva polepole na bila kubadilika, lakini data yetu inaonyesha kwamba inaweza kuunda niuroni ya matengenezo hata katika hatua kabla ya kifo cha seli. Utaratibu wa fidia ya utendaji kazi. Ugunduzi huu unaonyesha kwamba niuroni zina kiwango kikubwa cha unyumbufu wa kimetaboliki mwilini. Ukweli huu unathibitisha kwamba urejesho wa baadaye wa MFN2 unaweza kubadilisha usemi wa alama muhimu za kimetaboliki na kuzuia kuzorota kwa PN. Kinyume chake, huzuia atherosclerosis na kuharakisha mishipa.
Mojawapo ya matokeo ya kuvutia zaidi katika utafiti wetu ni kwamba PN zisizo na OXPHOS zinaweza kurekebisha kimetaboliki ya mzunguko wa TCA kwa kuongeza vimeng'enya vinavyodhibiti mishipa ya damu ambayo huchochea hasa arteriosclerosis. Upangaji upya wa kimetaboliki ni sifa ya kawaida ya seli za saratani, ambazo baadhi yake hutegemea glutamine kuongeza viunganishi vya mzunguko wa TCA ili kutoa sawa, ambavyo huendesha mnyororo wa kupumua na kudumisha uzalishaji wa vitangulizi vya biosynthesis ya lipid na nyukleotidi (39, 40). Utafiti wa hivi karibuni ulionyesha kuwa katika tishu za pembeni zinazopata hitilafu ya OXPHOS, kuunganishwa tena kwa kimetaboliki ya glutamine/glutamate pia ni sifa maarufu (5, 41), ambapo mwelekeo wa kuingia kwa glutamine kwenye mzunguko wa TCA unategemea Kwa sababu ya ukali wa jeraha la OXPHOS (41). Hata hivyo, kuna ukosefu wa ushahidi wazi kuhusu kufanana kwa unyumbufu wa kimetaboliki ya neva mwilini na umuhimu wake katika muktadha wa ugonjwa. Katika utafiti wa hivi karibuni wa ndani ya vitro, niuroni za msingi za gamba zilionyeshwa kuhamasisha mabwawa ya glutamate kwa ajili ya upitishaji wa neva, na hivyo kukuza kimetaboliki ya oksidi na atherosclerosis chini ya hali ya mkazo wa kimetaboliki (42). Inafaa kuzingatia kwamba chini ya kizuizi cha kifamasia cha kimeng'enya cha mzunguko wa TCA succinate dehydrogenase, kaboksilaiti ya pyruvati inaaminika kudumisha usanisi wa oxaloacetate katika niuroni za chembe chembe za serebela zilizokuzwa (34). Hata hivyo, umuhimu wa kifiziolojia wa mifumo hii kwa tishu za ubongo (ambapo atherosclerosis inaaminika kuwa imepunguzwa sana kwa astrocytes) bado una umuhimu muhimu wa kifiziolojia (43). Katika hali hii, data yetu inaonyesha kwamba PN zilizoharibiwa na OXPHOS mwilini zinaweza kubadilishwa hadi uharibifu wa BCAA na kaboksilaiti ya pyruvati, ambazo ndizo vyanzo viwili vikuu vya nyongeza ya viungo vya kati vya TCA. Ingawa mchango wa kimakisio wa ukataboli wa BCAA kwa umetaboli wa nishati ya neva umependekezwa, pamoja na jukumu la glutamate na GABA kwa ajili ya upitishaji wa neva (44), bado hakuna ushahidi wa mifumo hii katika mwili. Kwa hivyo, ni rahisi kudhani kwamba PN zisizofanya kazi zinaweza kufidia kiotomatiki matumizi ya viungo vya kati vya TCA vinavyoendeshwa na mchakato wa ufyonzaji kwa kuongeza atherosclerosis. Hasa, ongezeko la PCx linaweza kuhitajika ili kudumisha ongezeko la mahitaji ya asidi ya aspartiki, ambayo inapendekezwa katika seli zinazoongezeka zenye utendaji kazi usiofaa wa mitochondrial (45). Hata hivyo, uchambuzi wetu wa metabolomiki haukuonyesha mabadiliko yoyote muhimu katika kiwango cha hali thabiti cha asidi ya aspartiki katika Mfn2cKO PNs (Mchoro S6A), ambayo inaelekea inaonyesha matumizi tofauti ya kimetaboliki ya asidi ya aspartiki kati ya seli zinazoongezeka na niuroni za baada ya mitotiki. Ingawa utaratibu halisi wa ongezeko la PCx katika niuroni zisizofanya kazi vizuri katika mwili bado haujabainishwa, tulionyesha kuwa mwitikio huu wa mapema una jukumu muhimu katika kudumisha hali ya redoksi ya niuroni, ambayo ilionyeshwa katika majaribio ya FLIM kwenye vipande vya serebela. Hasa, kuzuia PNs kutokana na kuongeza udhibiti wa PCx kunaweza kusababisha hali iliyooksidishwa zaidi na kuharakisha kifo cha seli. Uanzishaji wa uharibifu wa BCAA na kaboksili ya pyruvate si njia za kuainisha tishu za pembeni za utendaji kazi usiofaa wa mitochondrial (7). Kwa hivyo, zinaonekana kuwa kipengele cha kipaumbele cha niuroni zenye upungufu wa OXPHOS, hata kama si kipengele pekee, ambacho ni muhimu kwa kuzorota kwa neva.
Ugonjwa wa serebela ni aina tofauti ya ugonjwa wa neva unaoharibika ambao kwa kawaida hujidhihirisha kama ataksia na mara nyingi huharibu PN (46). Idadi hii ya niuroni iko katika hatari kubwa ya kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria kwa sababu kuzorota kwao kwa kuchagua katika panya kunatosha kuzaa dalili nyingi za mwendo zinazoashiria ataksia ya spinocerebellar ya binadamu (16, 47, 48). Kulingana na ripoti, modeli ya panya iliyobadilishwa jeni yenye jeni iliyobadilishwa inahusishwa na ataksia ya spinocerebellar ya binadamu na ina kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria (49, 50), ikisisitiza umuhimu wa kusoma matokeo ya upungufu wa OXPHOS katika PNPH. Kwa hivyo, inafaa sana kutenganisha na kusoma idadi hii ya kipekee ya niuroni kwa ufanisi. Hata hivyo, ikizingatiwa kwamba PN ni nyeti sana kwa shinikizo na huhesabu sehemu ndogo ya idadi nzima ya seli za serebela, kwa tafiti nyingi zinazotegemea omiki, utenganisho wa kuchagua wao kama seli nzima bado ni jambo gumu. Ingawa ni vigumu kufikia ukosefu kamili wa uchafuzi wa aina zingine za seli (hasa tishu za watu wazima), tuliunganisha hatua madhubuti ya kutenganisha na FACS ili kupata idadi ya kutosha ya niuroni zinazofaa kwa ajili ya uchambuzi wa proteomics wa chini, na kuwa na kiwango cha juu cha protini (takriban protini 3000) ikilinganishwa na seti ya data iliyopo ya serebelamu nzima (51). Kwa kuhifadhi uhai wa seli nzima, njia tunayotoa hapa inaturuhusu sio tu kuangalia mabadiliko katika njia za kimetaboliki katika mitochondria, lakini pia kuangalia mabadiliko katika wenzao wa saitoplazimu, ambayo inakamilisha matumizi ya lebo za utando wa mitochondria ili kuimarisha aina ya seli. Njia mpya ya idadi ya mitochondria katika tishu tata (52, 53). Njia tunayoelezea haihusiani tu na utafiti wa seli za Purkinje, lakini inaweza kutumika kwa urahisi kwa aina yoyote ya seli kushughulikia mabadiliko ya kimetaboliki katika ubongo wenye magonjwa, ikiwa ni pamoja na mifano mingine ya kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria.
Hatimaye, tumegundua dirisha la matibabu wakati wa mchakato huu wa kupanga upya kimetaboliki ambalo linaweza kubadilisha kabisa dalili muhimu za msongo wa mawazo wa seli na kuzuia kuzorota kwa neva. Kwa hivyo, kuelewa athari za utendaji kazi wa kuunganisha upya nyaya zilizoelezwa hapa kunaweza kutoa ufahamu wa msingi kuhusu matibabu yanayowezekana ya kudumisha uhai wa neva wakati wa kutofanya kazi vizuri kwa mitochondria. Utafiti wa siku zijazo unaolenga kuchanganua mabadiliko katika umetaboli wa nishati katika aina zingine za seli za ubongo unahitajika ili kufichua kikamilifu utumiaji wa kanuni hii kwa magonjwa mengine ya neva.
Panya wa MitoPark wameelezewa hapo awali (31). Panya wa C57BL/6N wenye jeni za Mfn2 zilizo pembeni za loxP wameelezewa hapo awali (18) na kuchanganywa na panya wa L7-Cre (23). Kizazi cha heterozygous kilichotokea mara mbili kilichanganywa na panya wa homozygous wa Mfn2loxP/Mfn2loxP ili kutoa jeni maalum za Purkinje kwa Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Katika kundi la kujamiiana, aleli ya Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) ilianzishwa kupitia njia za ziada za kuvuka (20). Taratibu zote za wanyama zilifanywa kwa mujibu wa miongozo ya Ulaya, kitaifa na kitaasisi na kuidhinishwa na LandesamtfürNatur ya Umwelt na Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Ujerumani. Kazi za wanyama pia hufuata mwongozo wa Shirikisho la Ulaya la Vyama vya Sayansi ya Wanyama vya Maabara.
Baada ya kutuliza ganzi kutoka kwa seviksi ya mwanamke mjamzito, kiinitete cha panya hutengwa (E13). Gombo la ubongo lilikatwakatwa katika Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) iliyoongezewa 10 mM Hepes na kupitishwa kwa Dulbecco's Modified Eagle's Medium iliyo na papain (20 U/ml) na cysteine ​​​​(1μg/ml). Weka tishu katika DMEM) na kuitenganisha kwa usagaji wa kimeng'enya. Ml) kwa 37°C kwa dakika 20, na kisha kusagwa kwa kiufundi katika DMEM iliyoongezewa 10% ya seramu ya ng'ombe ya fetasi. Seli zilipandwa kwenye vifuniko vya glasi vilivyofunikwa na polylisini kwa msongamano wa 2×106 kwa kila sahani ya ufugaji ya sentimita 6 au kwa msongamano wa seli 0.5×105/cm2 kwa ajili ya uchambuzi wa picha. Baada ya saa 4, chombo hicho kilibadilishwa na chombo kisicho na seramu ya Neurobasal kilicho na 1% B27 na 0.5 mM GlutaMax. Kisha niuroni zilihifadhiwa kwenye 37°C na 5% CO2 katika jaribio lote, na kulishwa mara moja kwa wiki. Ili kuchochea uunganishaji upya ndani ya vitro, 3μl (sahani ya ufugaji wa visima 24) au 0.5μl (sahani ya visima 24) ya vekta ifuatayo ya virusi vya AAV9 ilitumika kutibu niuroni siku ya pili ndani ya vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nambari ya katalogi 105530-AAV9) na AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nambari ya katalogi 105545-AAV9).
DNA inayosaidiana ya Mfn1 na Mfn2 (iliyopatikana kutoka kwa plasmid ya Addgene #23212 na #23213, mtawalia) imewekwa alama na mfuatano wa V5 (GKPIPNPLLGLDST) kwenye sehemu ya mwisho ya C, na imeunganishwa na mCherry katika fremu kupitia mfuatano wa T2A. Grx1-roGFP2 ni zawadi kutoka kwa Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Kwa kubadilisha kaseti ya tdTomato kwa kutumia mbinu za kawaida za uundaji wa kloni, kaseti iliwekwa kwenye uti wa mgongo wa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nambari ya marejeleo ya Addgene 28306) ili kutoa vekta za pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 na pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Mkakati kama huo ulitumika kutengeneza vekta ya udhibiti pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Ili kutengeneza muundo wa AAV-shPCx, vekta ya plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) inahitajika, ambayo ina mfuatano wa DNA unaosimba PCx ya kipanya kinacholenga shRNA (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCCTTAGAGCGAAAG 3′) Chini ya udhibiti wa kipanya cha U6, mCherry hutumika chini ya udhibiti wa kipanya cha CMV. Uzalishaji wa vekta saidizi za AAV ulifanyika kulingana na maagizo ya mtengenezaji (Cell Biolabs). Kwa kifupi, tumia plazimu ya uhamisho iliyobeba mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) kwa muda mfupi. Uhamishaji wa seli 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) au jeni la usimbaji la Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), pamoja na usimbaji wa protini ya kapsidi ya AAV1 na protini ya ziada. Ufungashaji wa plazimudi ya plazimudi, kwa kutumia mbinu ya kalsiamu fosfeti. Kiini cha virusi ghafi kilipatikana kwa mizunguko ya kugandisha-kuyeyusha katika umwagaji kavu wa barafu/ethanoli na seli zilizosafishwa katika saline ya fosfeti iliyofungwa (PBS). Vekta ya AAV ilisafishwa kwa kutumia ultracentrifugation ya gradient ya iodixanol isiyoendelea (saa 24 kwa kasi ya 32,000 rpm na 4°C) na kuchanganywa kwa kutumia kichujio cha sentrifugal cha Amicon ultra-15. Kiwango cha jenomu cha AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [nakala ya jenomu ya 2.9×1013 (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX ilikuwa kama ilivyoelezwa hapo awali (54), ikipimwa kwa PCR ya kiasi cha wakati halisi (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) na AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Niuroni za msingi zilikwanguliwa katika PBS ya barafu 1x, zikawekwa kwenye pellet, na kisha zikawekwa katika bafa ya lysis ya Triton X-100 / 0.5% ya sodiamu deoksicholate/PBS iliyo na fosfati na kizuizi cha protease (Roche). Upimaji wa protini ulifanywa kwa kutumia kipimo cha asidi ya biinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Kisha protini zilitenganishwa na electrophoresis ya jeli ya SDS-polyacrylamide, na kisha zikafutwa kwenye utando wa floridi ya polyvinylidene (GE Healthcare). Zuia maeneo yasiyo maalum na uweke kwenye kingamwili ya msingi (tazama Jedwali S1 kwa maelezo zaidi) katika maziwa ya 5% katika TBST (Tris-buffered saline with Tween), hatua za kuosha na kingamwili ya pili katika TBST Incubate. Ingia kwenye kingamwili ya msingi usiku kucha kwa +4°C. Baada ya kuosha, paka kingamwili ya pili kwa saa 2 kwenye joto la kawaida. Baadaye, kwa kuweka blot sawa na kingamwili ya anti-β-actin, mzigo huo huo ulithibitishwa. Ugunduzi kwa kugeuza kuwa chemiluminescence na kuongeza chemiluminescence (GE Healthcare).
Niuroni zilizopandwa hapo awali kwenye vifuniko vya glasi zilirekebishwa na 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS katika muda uliowekwa kwenye halijoto ya kawaida kwa dakika 10. Vifuniko vya kwanza huingizwa na 0.1% Triton X-100/PBS kwa dakika 5 kwenye halijoto ya kawaida, na kisha kwenye kizuizi cha kuzuia [3% ya albumin ya seramu ya ng'ombe (BSA)/PBS]. Siku ya pili, vifuniko vilioshwa na kizuizi cha kuzuia na kuwekwa kwenye kingamwili ya pili iliyounganishwa na fluorophore kwa saa 2 kwenye halijoto ya kawaida; hatimaye, sampuli zilioshwa vizuri katika PBS na 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) imefunikwa na rangi kisha kuwekwa kwenye slaidi ya darubini kwa kutumia Aqua-Poly/Mount.
Panya (wa kiume na wa kike) walidungwa dawa ya ganzi kwa sindano ya ndani ya peritoneal ya ketamine (130 mg/kg) na xylazine (10 mg/kg) na kutolewa kwa njia ya chini ya ngozi kwa kutumia dawa ya kutuliza maumivu ya carprofen (5 mg/kg), na kuwekwa kwenye kifaa cha stereotactic (Kopf) chenye pedi ya joto. Fungua fuvu na utumie kitoboa cha meno kupunguza sehemu ya cerebellar cortex inayolingana na mfupa wa mis (kutoka lambda: mkia 1.8, pembeni 1, inayolingana na lobules IV na V). Tumia sindano ya sindano iliyopinda ili kutengeneza shimo dogo kwenye fuvu kwa uangalifu ili kuepuka kuvuruga mishipa ya damu iliyo chini. Kisha kapilari nyembamba ya kioo iliyochorwa huingizwa polepole kwenye shimo dogo (kutoka -1.3 hadi -1 upande wa ndani wa dura mater), na AAV 200 hadi 300 nl hudungwa kwenye sindano ndogo (Narishige) kwa kutumia sindano za mwongozo (Narishige) mara kadhaa kwa shinikizo la chini kwa muda wa dakika 10 hadi 20. Baada ya kuingizwa, weka kapilari kwa dakika nyingine 10 ili kuruhusu virusi kuenea kabisa. Baada ya kapilari kutolewa, ngozi hushonwa kwa uangalifu ili kupunguza uvimbe wa jeraha na kumruhusu mnyama kupona. Wanyama walitibiwa na dawa za kutuliza maumivu (caspofen) kwa siku kadhaa baada ya upasuaji, ambapo hali yao ya kimwili ilifuatiliwa kwa uangalifu na kisha wakauawa kwa wakati uliowekwa. Taratibu zote zilifanywa kwa mujibu wa miongozo ya Ulaya, kitaifa na kitaasisi na ziliidhinishwa na LandesamtfürNatur ya Umwelt na Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Ujerumani.
Wanyama waligandishwa kwa kutumia ketamine (100 mg/kg) na xylazine (10 mg/kg), na moyo ulijazwa na 0.1 M PBS kwanza, na kisha 4% PFA katika PBS. Tishu ilikatwakatwa na kuwekwa katika 4% PFA/PBS usiku kucha kwa 4°C. Kisu kinachotetemeka (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) kilitumika kuandaa sehemu za sagittal (unene wa 50 μm) kutoka kwa ubongo uliowekwa katika PBS. Isipokuwa imeainishwa vinginevyo, kuchafua sehemu zinazoelea kwa uhuru kulifanywa kama ilivyoelezwa hapo juu (13) kwenye joto la kawaida na kukoroga. Kwa kifupi, kwanza, vipande vilivyopatikana vilipenyeza kwa 0.5% Triton X-100/PBS kwa dakika 15 kwenye joto la kawaida; kwa baadhi ya epitopes (Pcx na Shmt2), kwa kutumia tris-EDTA buffer kwa 80°C (PH 9) pasha moto vipande kwa dakika 25 badala ya hatua hii. Kisha, sehemu hizo ziliwekwa kingamwili ya msingi (tazama Jedwali S1) katika kizuizi cha kuzuia (3% BSA/PBS) kwa 4°C usiku kucha kwa kukoroga. Siku iliyofuata, sehemu hizo zilioshwa kwa kizuizi cha kuzuia na kuwekwa kingamwili ya pili inayofaa iliyounganishwa na fluorophore kwa saa 2 kwenye joto la kawaida; hatimaye, sehemu hizo zilioshwa vizuri katika PBS, zikawekwa rangi ya DAPI, na kisha zikawekwa kwa slaidi ya darubini ya AquaPolymount.
Darubini ya confocal ya skanning ya leza (TCS SP8-X au TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) iliyo na leza nyeupe ya mwanga na leza ya ultraviolet ya diode 405 ilitumika kupiga picha sampuli. Kwa kusisimua fluorophore na kukusanya ishara kwa kutumia Hybrid Detector (HyDs), programu ya LAS-X ilitumika kukusanya picha zilizorundikwa zinazolingana na sampuli ya Nyquist katika hali ya mfuatano: kwa paneli zisizo za kiasi, ni ishara zenye nguvu sana (kwa mfano, katika seli za mwili na dendrites) mtYFP) Tumia HyD kugundua idadi ya PN katika hali ya BrightR). Gati kutoka 0.3 hadi 6 ns inatumika kupunguza mandharinyuma.
Upigaji picha wa wakati halisi wa seli zilizopangwa. Baada ya kupanga katika Neurobasal-A medium iliyo na 1% B27 nyongeza na 0.5 mM GlutaMax, seli zilipandwa mara moja kwenye slaidi za glasi zilizofunikwa na poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, nambari ya katalogi 80826), Na kisha kuiweka kwenye 37°C na 5% CO2 kwa saa 1 ili kuruhusu seli kutulia. Upigaji picha wa wakati halisi ulifanywa kwenye darubini ya confocal ya skanning ya leza ya Leica SP8 iliyo na leza nyeupe, HyD, lenzi ya obiti ya mafuta ya 63×[1.4 numeral aperture (NA)] na hatua ya kupasha joto.
Panya alipakwa ganzi haraka kwa kutumia kaboni dioksidi na kukatwa kichwa, ubongo uliondolewa haraka kutoka kwenye fuvu, na kukatwa vipande vipande na kuwa na unene wa 200μm (kwa jaribio la kuweka lebo la 13C) au unene wa 275μm (kwa majaribio mawili ya fotoni) sehemu ya sagittal iliyojazwa na vifaa vifuatavyo. Aiskrimu (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Ujerumani) imejaa vitu vifuatavyo: 125 mM baridi-barafu, iliyojaa kaboni (95% O2 na 5% CO2) Ca2 ya chini + maji bandia ya ubongo (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukosi, 0.5 mM CaCl2 na 3.5 mM MgCl2 (shinikizo la osmotiki la 310 hadi 330 mmol). Hamisha vipande vya ubongo vilivyopatikana kwenye chumba cha kabla ya kuanguliwa chenye Ca2 + ACSF ya juu zaidi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium fosfeti buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 na 2.0 mM MgCl2) pH 7.4 na 310 hadi 320 mmol).
Wakati wa mchakato wa upigaji picha, vipande hivyo vilihamishiwa kwenye chumba maalum cha upigaji picha, na jaribio hilo lilifanywa chini ya upitishaji wa ACSF unaoendelea kwenye halijoto isiyobadilika ya 32° hadi 33°C. Darubini ya skanning ya leza yenye picha nyingi (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) iliyo na lenzi ya lengo ya Leica 25x (NA 0.95, maji), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ilitumika kwa upigaji picha wa vipande. Moduli ya FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ya Grx1-roGFP2. Mabadiliko katika hali ya redoksi ya saitoplazimu ya PN yalipimwa na FLIM ya fotoni mbili katika vipande vya ubongo wa sagittal, ambapo kihisi cha kibiolojia cha Grx1-roGFP2 kililenga PN. Katika safu ya PN, sehemu ya upatikanaji huchaguliwa takriban μm 50 hadi 80 chini ya uso wa kipande ili kuhakikisha kwamba kuna PN inayoweza kutumika (yaani, ukosefu wa muundo ulio na shanga au mabadiliko ya kimofolojia ya niuroni kando ya dendrites) na kihisi cha roGFP2 chanya maradufu na usimbaji wa AAV shRNA PCx au mfuatano wake wa udhibiti (kila mCherry inayoonyesha ushirikiano). Kusanya picha za rundo moja zenye zoom ya dijiti ya 2x [urefu wa wimbi la msisimko: 890 nm; 512 nm pikseli 512]. Ugunduzi: HyD ya ndani, kikundi cha kichujio cha fluorescein isothiocyanate (FITC)] na wastani wa picha ndani ya dakika 2 hadi 3 hutumika kuhakikisha kwamba fotoni za kutosha zinakusanywa (fotoni 1000 kwa jumla) kwa ajili ya kufaa kwa mkunjo. Usikivu wa probe ya Grx1-roGFP2 na uthibitishaji wa hali za FLIM ulifanywa kwa kufuatilia thamani ya maisha ya roGFP2 wakati wa kuongeza H2O2 ya nje ya 10 mM kwenye ACSF ya upitishaji (ili kuongeza oksidi, na kusababisha kuongezeka kwa maisha), na kisha kuongeza dithiothreitol ya 2 mM (hupunguza kiwango cha upunguzaji, na kusababisha kupungua kwa maisha) (Mchoro S8, D hadi G). Tumia programu ya FLIMfit 5.1.1 kuchanganua matokeo yaliyopatikana, linganisha mkunjo mmoja wa uozo wa kielelezo wa picha nzima na IRF iliyopimwa (kazi ya mwitikio wa ala), na χ2 ni takriban 1. Ili kuhesabu maisha ya PN moja, barakoa inayozunguka mwili wa neva ilichorwa kwa mkono, na maisha ya wastani katika kila barakoa ilitumika kwa upimaji.
Uchambuzi wa uwezo wa mitochondria. Baada ya sehemu ya papo hapo kuingizwa na 100 nM TMRM iliyoongezwa moja kwa moja kwenye ACSF iliyosafishwa kwa dakika 30, mabadiliko ya uwezo wa mitochondria ya PN yalipimwa kwa darubini ya fotoni mbili. Upigaji picha wa TMRM ulifanywa kwa kusisimua probe kwenye 920 nm na kutumia HyD ya ndani (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) kukusanya ishara; kwa kutumia urefu sawa wa msisimko lakini kwa kutumia HyD tofauti ya ndani (FITC :525/50) ili kupiga picha mtYFP. Tumia programu-jalizi ya Kikokotoo cha Picha cha ImageJ ili kutathmini uwezo wa mitochondria katika kiwango cha seli moja. Kwa kifupi, mlinganyo wa programu-jalizi: ishara = min (mtYFP, TMRM) hutumika kutambua eneo la mitochondria linaloonyesha ishara ya TMRM katika Purkinje Somali katika picha ya confocal ya rundo moja ya chaneli inayolingana. Kisha eneo la pikseli katika barakoa inayotokana hupimwa, na kisha hurekebishwa kwenye picha ya kizingiti kinacholingana cha mtaro mmoja wa mtYFP ili kupata sehemu ya mitochondrial inayoonyesha uwezo wa mitochondrial.
Picha iliondolewa msongamano kwa kutumia programu ya Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Kwa picha zilizochanganuliwa za vigae, uundaji wa vigae moja hufanywa kwa kutumia algoriti ya kushona kiotomatiki inayotolewa na programu ya LAS-X. Baada ya urekebishaji wa picha, tumia ImageJ na Adobe Photoshop ili kusindika zaidi picha na kurekebisha mwangaza na utofautishaji kwa usawa. Tumia Adobe Illustrator kwa ajili ya maandalizi ya picha.
Uchambuzi wa umakini wa mtDNA. Idadi ya vidonda vya mtDNA ilipimwa kwenye sehemu za serebela zilizoandikwa kwa kingamwili dhidi ya DNA kwa darubini ya confocal. Kila eneo lengwa liliundwa kwa ajili ya mwili wa seli na kiini cha kila seli, na eneo husika lilihesabiwa kwa kutumia programu-jalizi ya Vipimo Vingi (programu ya ImageJ). Toa eneo la nyuklia kutoka eneo la mwili wa seli ili kupata eneo la saitoplazimu. Hatimaye, programu-jalizi ya Chembe za Uchambuzi (programu ya ImageJ) ilitumika kupima kiotomatiki nukta za saitoplazimu za DNA zinazoonyesha mtDNA kwenye picha ya kizingiti, na matokeo yaliyopatikana yalirekebishwa hadi wastani wa PN wa panya wa CTRL. Matokeo yanaonyeshwa kama wastani wa idadi ya nyukleoside kwa kila seli.
Uchambuzi wa usemi wa protini. Tumia programu-jalizi ya Kikokotoo cha Picha cha ImageJ ili kutathmini usemi wa protini katika PN katika kiwango cha seli moja. Kwa kifupi, katika picha ya siri ya safu moja ya chaneli inayolingana, kupitia mlinganyo: ishara = min (mtYFP, kingamwili), eneo la mitochondrial linaloonyesha reactivity ya kingamwili kwa kingamwili fulani katika Purkina hutambuliwa. Kisha eneo la pikseli katika barakoa inayotokana hupimwa, na kisha hurekebishwa kwenye picha ya kizingiti kinacholingana cha chaneli ya mtYFP ili kupata sehemu ya mitochondrial ya protini inayoonyeshwa.
Uchambuzi wa msongamano wa seli za Purkinje. Programu-jalizi ya Kihesabu cha Seli ya ImageJ ilitumika kutathmini msongamano wa Purkinje kwa kugawanya idadi ya seli za Purkinje zilizohesabiwa kwa urefu wa pete ya serebela inayokaliwa na seli zilizohesabiwa.
Maandalizi na ukusanyaji wa sampuli. Ubongo kutoka kwa kundi la udhibiti na panya wa Mfn2cKO uliwekwa kwenye 2% PFA/2.5% glutaraldehyde katika 0.1 M fosfeti buffer (PB), na kisha sehemu za korona zilitayarishwa kwa kutumia ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Unene 50 hadi 60 μm). Kisha weka kwenye PB buffer katika 1% os tetraoksidi na 1.5% potasiamu ferrocyanidi kwenye joto la kawaida kwa saa 1. Sehemu hizo zilioshwa mara tatu kwa maji yaliyosafishwa, na kisha kuchafuliwa na 70% ethanoli yenye 1% uranyl acetate kwa dakika 20. Sehemu hizo kisha zikakaushwa kwenye alkoholi iliyopangwa na kupachikwa kwenye Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) kati ya slaidi za glasi zilizofunikwa na silikoni, na hatimaye kwenye 60°C Polima katika oveni kwa saa 48. Eneo la gamba la serebela lilichaguliwa na sehemu nyembamba sana za nanomita 50 zilikatwa kwenye Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) na kuchaguliwa kwenye gridi ya shaba ya 2×1 mm iliyofunikwa na filamu ya polistini. Sehemu hizo zilitiwa rangi ya myeyusho wa asetati ya uranyli 4% katika H2O kwa dakika 10, zikaoshwa na H2O mara kadhaa, kisha zikaoshwa na citrate ya risasi ya Reynolds katika H2O kwa dakika 10, kisha zikaoshwa na H2O mara kadhaa. Mikrografu zilichukuliwa kwa darubini ya elektroni ya maambukizi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Marekani) kwa kutumia kamera ya dijitali ya TVIPS (Mfumo wa Usindikaji wa Video na Picha wa Tietz) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Marekani). Ujerumani).
Kwa panya walioambukizwa AAV, ubongo ulitenganishwa na kukatwa vipande vipande katika sehemu ya sagittal yenye unene wa milimita 1, na serebela ilichunguzwa kwa kutumia darubini ya fluorescence ili kutambua pete iliyoambukizwa AAV (yaani, mCherry expressing). Majaribio pekee ambayo sindano ya AAV husababisha ufanisi mkubwa sana wa upitishaji wa safu ya seli ya Purkinje (yaani karibu safu nzima) katika angalau pete mbili mfululizo za serebela ndiyo yanayotumika. Kitanzi kilichopitishwa na AAV kilikatwakatwa kwa ajili ya urekebishaji wa usiku mmoja (4% PFA na 2.5% glutaraldehyde katika bafa ya kakaoti ya 0.1 M) na kusindika zaidi. Kwa upachikaji wa EPON, tishu zilizowekwa zilioshwa na bafa ya kakaoti ya sodiamu ya 0.1 M (Applichem), na kufunikwa na 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) katika bafa ya kakaoti ya sodiamu ya 0.1 M (Applichem) kwa saa 4, kisha osha kwa saa 2. Rudia mara 3 na bafa ya kakaoti ya 0.1 M. Baadaye, mfululizo wa ethanoli uliokuwa ukipanda ulitumika kuangushia kila myeyusho wa ethanoli kwenye 4°C kwa dakika 15 ili kuua maji kwenye tishu. Tishu hiyo ilihamishiwa kwenye oksidi ya propylene na kuangushiwa usiku kucha katika EPON (Sigma-Aldrich) kwenye 4°C. Weka tishu kwenye EPON mpya kwenye joto la kawaida kwa saa 2, kisha uipachike kwenye 62°C kwa saa 72. Tumia ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) na kisu cha almasi (Diatome, Biel, Switzerland) kukata sehemu nyembamba sana za 70 nm, na upake rangi kwa kutumia 1.5% uranyl acetate kwa dakika 15 kwa 37°C, na upake rangi kwa kutumia myeyusho wa sitrate ya risasi kwa dakika 4. Mikrografu za elektroni zilichukuliwa kwa kutumia darubini ya elektroni ya upitishaji ya JEM-2100 Plus (JEOL) iliyo na programu ya Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) na DigitalMicrograph (Gatan). Kwa ajili ya uchambuzi, mikrografu za elektroni zilipatikana kwa kutumia zoom ya kidijitali ya 5000× au 10,000×.
Uchambuzi wa kimofolojia wa mitochondria. Kwa uchanganuzi wote, miinuko ya mitochondria ya mtu binafsi iliainishwa kwa mikono katika picha za kidijitali kwa kutumia programu ya ImageJ. Vigezo tofauti vya kimofolojia vinachambuliwa. Msongamano wa mitochondria huonyeshwa kama asilimia inayopatikana kwa kugawanya eneo lote la mitochondria la kila seli na eneo la saitoplazimu (eneo la saitoplazimu = eneo la seli-eneo la kiini cha seli) × 100. Uzito wa mitochondria huhesabiwa kwa kutumia fomula [4π∙(eneo/mzunguko 2)]. Mofolojia ya ista ya mitochondria ilichambuliwa na kugawanywa katika kategoria mbili ("tubular" na "blister") kulingana na maumbo yao makuu.
Uchambuzi wa nambari ya autophagosomu/lisosomu na msongamano. Tumia programu ya ImageJ kuelezea kwa mikono mtaro wa kila autophagosomu/lisosomu katika picha ya kidijitali. Eneo la autophagosomu/lisosomu huonyeshwa kama asilimia inayohesabiwa kwa kugawanya jumla ya eneo la muundo wa autophagosomu/lisosomu la kila seli na eneo la saitoplazimu (eneo la saitoplazimu=eneo la eneo la seli-kiini)×100. Msongamano wa autophagosomu/lisosomu huhesabiwa kwa kugawanya jumla ya nambari kwa idadi ya miundo ya autophagosomu/lisosomu kwa kila seli (kwa upande wa eneo la saitoplazimu) (eneo la saitoplazimu = eneo la seli-eneo la nyuklia).
Kuweka lebo kwa ajili ya kugawanyika kwa papo hapo na maandalizi ya sampuli. Kwa majaribio yanayohitaji kuweka lebo ya glukosi, hamisha vipande vya ubongo papo hapo kwenye chumba cha kabla ya kuanguliwa, ambacho kina kaboni iliyojaa (95% O2 na 5% CO2), Ca2 + ACSF ya juu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium fosfeti buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 na 2.0 mM MgCl2, iliyorekebishwa kwa pH 7.4 na 310 hadi 320 mOsm), ambapo glukosi ni 13 C 6- Uingizwaji wa glukosi (Eurisotop, nambari ya katalogi CLM-1396). Kwa majaribio yanayohitaji uwekaji lebo wa pyruvate, hamisha vipande vya ubongo vya papo hapo hadi Ca2 + ACSF ya juu zaidi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 na Ongeza 2.0mM MgCl2, rekebisha hadi pH 7.4 na 310 hadi 320mOsm), na ongeza 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nambari ya katalogi CLM-1082). Weka sehemu hizo kwa dakika 90 kwa 37°C. Mwishoni mwa jaribio, sehemu hizo zilioshwa haraka kwa mchanganyiko wa maji (pH 7.4) ulio na 75 mM ammonium carbonate, na kisha zikabadilishwa kuwa homogenized katika 40:40:20 (v:v:v) asetonitrile (ACN): methanoli: maji. Baada ya sehemu hizo kuanguliwa kwenye barafu kwa dakika 30, sampuli ziliwekwa kwenye centrifuge kwa 21,000 g kwa dakika 10 kwa 4°C, na supernatant iliyo wazi ilikaushwa kwenye concentrator ya SpeedVac. Pellet ya metabolite iliyokaushwa iliyotokana ilihifadhiwa kwa -80°C hadi uchambuzi utakapokamilika.
Uchambuzi wa spektrometria ya kromatografi ya kioevu-spektrometria ya asidi 13 za amino zenye lebo ya C. Kwa uchanganuzi wa spektrometria ya kromatografi ya kioevu-spektrometria ya wingi (LC-MS), chembe ya metabolite ilisimamishwa tena katika 75μl ya maji ya daraja la LC-MS (Honeywell). Baada ya kusukuma kwa centrifugation kwenye 21,000 g kwa dakika 5 kwa 4°C, 20μl ya supernatant iliyofafanuliwa ilitumika kwa uchanganuzi wa mtiririko wa amino asidi, huku sehemu iliyobaki ya dondoo ikitumika mara moja kwa uchanganuzi wa anioni (tazama hapa chini). Uchanganuzi wa asidi ya amino ulifanywa kwa kutumia itifaki ya uondoaji wa kloridi ya benzoyl iliyoelezwa hapo awali (55, 56). Katika hatua ya kwanza, 10μl ya kaboneti ya sodiamu 100 mM (Sigma-Aldrich) iliongezwa kwenye 20μl ya dondoo ya metabolite, na kisha 10μl ya kloridi ya benzoyl 2% (Sigma-Aldrich) iliongezwa kwenye ACN ya daraja la LC. Sampuli ilichujwa kwa muda mfupi na kisha ikazungushwa kwa centrifuge kwa 21,000 g kwa dakika 5 kwa joto la 20°C. Hamisha supernatant iliyosafishwa kwenye kichupa cha sampuli otomatiki cha 2 ml chenye kiingilio cha kioo chenye umbo la koni (200 μl ujazo). Sampuli zilichambuliwa kwa kutumia mfumo wa Acquity iClass ultra-high performance LC (Waters) uliounganishwa na spektromita ya usahihi wa juu wa Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Kwa uchambuzi, 2μl ya sampuli iliyotokana ilidungwa kwenye safu wima ya T3 ya silika yenye nguvu ya 100×1.0 mm (Waters) yenye chembe za 1.8μm. Kiwango cha mtiririko ni 100μl/min, na mfumo wa buffer una buffer A (formate ya ammonium ya 10 mM na asidi ya formic ya 0.15% katika maji) na buffer B (ACN). Mteremko ni kama ifuatavyo: 0%B kwa dakika 0; 0%B. 0 hadi 15% B kwa dakika 0 hadi 0.1; 15 hadi 17% B kwa dakika 0.1 hadi 0.5; B kwa 17 hadi 55% kwa dakika 0.5 hadi 14; B kwa 55 hadi 70% kwa dakika 14 hadi 14.5; kwa 14.5 hadi 70 hadi 100% B kwa dakika 18; 100% B kwa dakika 18 hadi 19; 100 hadi 0% B kwa dakika 19 hadi 19.1; 0% B kwa dakika 19.1 hadi 28 (55, 56). Spektromita ya wingi ya QE-HF hufanya kazi katika hali chanya ya ionisheni yenye kiwango cha uzito cha m/z (uwiano wa uzito/chaji) cha 50 hadi 750. Azimio linalotumika ni 60,000, na shabaha ya ioni ya kudhibiti faida (AGC) iliyopatikana ni 3×106, na muda wa juu zaidi wa ioni ni milisekunde 100. Chanzo cha ionisheni ya electrospray yenye joto (ESI) hufanya kazi kwa volteji ya kunyunyizia ya 3.5 kV, halijoto ya kapilari ya 250°C, mtiririko wa hewa wa ala ya 60 AU (vitengo holela), na mtiririko wa hewa msaidizi wa 20 AU. 250°C. Lenzi ya S imewekwa kuwa 60 AU.
Uchambuzi wa kromatografia ya anioni-MS wa asidi kikaboni zenye lebo ya 13C. Usawazishaji wa kimetaboliki uliobaki (55μl) ulichambuliwa kwa kutumia mfumo wa kromatografia ya ioni ya Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) uliounganishwa na spektromita ya wingi ya QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Kwa kifupi, 5μl ya dondoo ya kimetaboliki iliingizwa kwenye safu wima ya Dionex IonPac AS11-HC iliyo na HPLC (2 mm×250 mm, ukubwa wa chembe 4μm, Thermo Fisher Scientific) katika hali ya kitanzi cha kusukuma ndani chenye uwiano wa kujaza wa 1. ) safu wima ya ulinzi ya Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Joto la safu wima hudumishwa kwa 30°C, na kipima-sampler kimewekwa hadi 6°C. Tumia katriji ya hidroksidi ya potasiamu iliyotolewa na maji yaliyoondolewa ioni ili kutoa gradient ya hidroksidi ya potasiamu kupitia jenereta ya eluent. Mgawanyiko wa metaboliti kwa kiwango cha mtiririko wa 380μl/dakika, kwa kutumia mteremko ufuatao: dakika 0 hadi 3, 10 mM KOH; dakika 3 hadi 12, 10 hadi 50 mM KOH; dakika 12 hadi 19, 50 hadi 100 mM KOH; dakika 19 hadi 21, 100 mM KOH; dakika 21 hadi 21.5, 100 hadi 10 mM KOH. Safu ilirekebishwa tena chini ya 10 mM KOH kwa dakika 8.5.
Metaboliti zilizoepukwa huunganishwa na mkondo wa nyongeza wa isopropanol wa 150μl/min baada ya safu wima na kisha kuelekezwa kwenye spectromita ya uzito yenye ubora wa juu inayofanya kazi katika hali ya ioni hasi. MS inafuatilia kiwango cha uzito kutoka m/z 50 hadi 750 na ubora wa 60,000. AGC imewekwa kuwa 1×106, na muda wa juu zaidi wa ioni huhifadhiwa kwa 100 ms. Chanzo cha ESI kilichopashwa joto kiliendeshwa kwa voltage ya kunyunyizia ya 3.5 kV. Mipangilio mingine ya chanzo cha ioni ni kama ifuatavyo: halijoto ya kapilari 275°C; mtiririko wa gesi ya ala, 60 AU; mtiririko wa gesi saidizi, 20 AU kwa 300°C, na mpangilio wa lenzi ya S hadi 60 AU.
Uchambuzi wa data wa metaboliti zenye lebo ya 13C. Tumia programu ya TraceFinder (toleo la 4.2, Thermo Fisher Scientific) kwa uchambuzi wa data wa uwiano wa isotopu. Utambulisho wa kila kiwanja ulithibitishwa na kiwanja cha marejeleo kinachoaminika na kuchambuliwa kwa kujitegemea. Ili kufanya uchambuzi wa utajiri wa isotopu, eneo la kromatogramu ya ioni iliyotolewa (XIC) ya kila isotopu ya 13C (Mn) lilitolewa kutoka [M + H]+, ambapo n ni nambari ya kaboni ya kiwanja lengwa, kinachotumika kuchanganua amino asidi au [MH] + hutumika kuchanganua anioni. Usahihi wa wingi wa XIC ni chini ya sehemu tano kwa milioni, na usahihi wa RT ni dakika 0.05. Uchanganuzi wa utajiri hufanywa kwa kuhesabu uwiano wa kila isotopu iliyogunduliwa na jumla ya isotopu zote za kiwanja kinacholingana. Uwiano huu hupewa kama thamani ya asilimia kwa kila isotopu, na matokeo yanaonyeshwa kama utajiri wa asilimia ya molar (MPE), kama ilivyoelezwa hapo awali (42).
Kidonge cha niuroni kilichogandishwa kilibadilishwa kuwa homogenized katika methanoli 80% (v/v) yenye barafu, kilichopakwa vortex, na kuwekwa kwenye incubation kwa -20°C kwa dakika 30. Changanya sampuli tena na koroga kwa +4°C kwa dakika 30. Sampuli iliwekwa kwenye centrifuge kwa 21,000 g kwa dakika 5 kwa 4°C, na kisha supernatant iliyotokana ilikusanywa na kukaushwa kwa kutumia kikontena cha SpeedVac kwa 25°C kwa uchambuzi unaofuata. Kama ilivyoelezwa hapo juu, uchambuzi wa LC-MS ulifanywa kwenye amino asidi za seli zilizopangwa. Kwa kutumia TraceFinder (toleo la 4.2, Thermo Fisher Scientific), uchambuzi wa data ulifanywa kwa kutumia uzito wa monoisotopic wa kila kiwanja. Urekebishaji wa kiasi cha data ya metabolite ulifanywa kwa kutumia kifurushi cha programu cha preprocessCore (57).
Maandalizi ya vipande. Panya alipakwa ganzi haraka kwa kutumia kaboni dioksidi na kukatwa kichwa, ubongo uliondolewa haraka kutoka kwenye fuvu, na kisu cha kutetemeka kilichojaa barafu (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Ujerumani) kilitumika kuikata vipande vya 300 hadi 375 μm sagittal gasification (95% O2 na 5% CO2) Ca2 ya chini + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 na 6.0 mM MgCl2 Rekebisha hadi pH 7.4 na 310 hadi 330 mOsm). Hamisha vipande vya ubongo vilivyopatikana kwenye chumba chenye Ca2 + ACSF ya juu zaidi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 na mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 na 310 hadi 320 mOsm). Hifadhi vipande hivyo kwa dakika 20 hadi 30 ili viweze kurejeshwa kabla ya kurekodi.
kurekodi. Hatua ya darubini iliyo na chumba cha kurekodi kisichobadilika na lenzi ya lengo la kuzamishwa majini ya mara 20 (Scientifica) ilitumika kwa rekodi zote. Seli za Purkinje zinazodhaniwa zilitambuliwa kwa (i) ukubwa wa mwili, (ii) eneo la anatomia la serebelamu, na (iii) usemi wa jeni la mtoa taarifa wa mtYFP. Bomba la kiraka lenye upinzani wa ncha ya megohms 5 hadi 11 hutolewa na kapilari ya glasi ya borosilicate (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Ujerumani) na bomba la mlalo Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Rekodi zote zilifanywa na amplifier ya clamp ya kiraka cha ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Ujerumani), ambayo ilidhibitiwa na programu ya Signal (toleo la 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Uingereza). Jaribio lilirekodiwa kwa kiwango cha sampuli cha 12.5 kHz. Ishara huchujwa kwa kutumia vichujio viwili vya Bessel vya kupitisha kwa muda mfupi vyenye masafa ya kukata ya 1.3 na 10 kHz mtawalia. Uwezo wa utando na bomba hulipwa na saketi ya fidia kwa kutumia amplifier. Majaribio yote yalifanywa chini ya udhibiti wa kamera ya Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Ujerumani), ambayo ilidhibitiwa na programu ya Hokawo (toleo la 2.8, Hamamatsu, Gerden, Ujerumani).
Panga usanidi na uchambuzi wa seli nzima mara kwa mara. Mara moja kabla ya kurekodi, jaza bomba na myeyusho wa ndani ulio na vitu vifuatavyo: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) na 10.0 mM creatinine fosfeti zilirekebishwa hadi pH 7.25, na shinikizo la osmotiki lilikuwa 290 mOsm (sucrose). Mara tu baada ya kutumia nguvu ya 0 pA ili kupasua utando, uwezo wa utando uliopumzika ulipimwa. Upinzani wa ingizo hupimwa kwa kutumia mikondo ya hyperpolarized ya -40, -30, -20, na -10 pA. Pima ukubwa wa mwitikio wa volteji na utumie sheria ya Ohm kuhesabu upinzani wa ingizo. Shughuli ya hiari ilirekodiwa katika kibano cha volteji kwa dakika 5, na sPSC ilitambuliwa na kupimwa katika Igor Pro (toleo la 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, Marekani) kwa kutumia hati ya utambuzi wa nusu otomatiki. Mkondo wa IV na mkondo wa hali thabiti hupimwa kwa kubana betri kwa uwezo tofauti (kuanzia -110 mV) na kuongeza volteji katika hatua 5 za mV. Uzalishaji wa AP ulijaribiwa kwa kutumia mkondo wa kuondoa polarizing. Bandika seli kwa -70 mV huku ukitumia mapigo ya mkondo wa kuondoa polarizing. Rekebisha ukubwa wa hatua ya kila kitengo cha kurekodi kando (10 hadi 60 pA). Kokotoa masafa ya juu ya AP kwa kuhesabu kwa mikono miiba ya mapigo inayosababisha masafa ya juu zaidi ya AP. Kizingiti cha AP kinachambuliwa kwa kutumia derivative ya pili ya mapigo ya kuondoa polarizing ambayo kwanza husababisha AP moja au zaidi.
Usanidi na uchambuzi wa kiraka kilichotoboka. Fanya kurekodi kiraka kilichotoboka kwa kutumia itifaki za kawaida. Tumia bomba lisilo na ATP na GTP ambalo halina viungo vifuatavyo: gluconate K 128 mM, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA na 2 mM MgCl2, na urekebishe hadi pH 7.2 (kwa kutumia KOH). ATP na GTP huondolewa kwenye suluhisho la ndani ya seli ili kuzuia upenyezaji usiodhibitiwa wa utando wa seli. Bomba la kiraka hujazwa na suluhisho la ndani lenye amphotericin (takriban 200 hadi 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ili kupata rekodi ya kiraka iliyotoboka. Amphotericin iliyeyushwa katika dimethyl sulfoxide (kiwango cha mwisho: 0.1 hadi 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Mkusanyiko wa DMSO uliotumika haukuwa na athari kubwa kwenye niuroni zilizosomwa. Wakati wa mchakato wa kupiga, upinzani wa chaneli (Ra) ulifuatiliwa kila mara, na jaribio lilianza baada ya ukubwa wa Ra na AP kutulia (dakika 20-40). Shughuli ya hiari hupimwa katika volteji na/au clamp ya mkondo kwa dakika 2 hadi 5. Uchambuzi wa data ulifanywa kwa kutumia Igor Pro (toleo la 7.05.2, WaveMetrics, Marekani), Excel (toleo la 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Marekani) na GraphPad Prism (toleo la 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Marekani). Ili kutambua AP za hiari, programu-jalizi ya IgorPro ya NeuroMatic v3.0c hutumiwa. Tambua kiotomatiki AP kwa kutumia kizingiti kilichotolewa, ambacho hurekebishwa kibinafsi kwa kila rekodi. Kwa kutumia muda wa spike, amua masafa ya spike yenye masafa ya juu ya spike ya papo hapo na masafa ya wastani ya spike.
Kutengwa kwa PN. Kwa kuzoea itifaki iliyochapishwa hapo awali, PN zilisafishwa kutoka kwa serebelamu ya panya katika hatua maalum (58). Kwa kifupi, serebelamu ilikatwakatwa na kung'olewa katika njia ya kutenganisha ya barafu [bila HBSS Ca2+ na Mg2+, ikiongezewa glukosi ya 20 mM, penicillin (50 U/ml) na streptomycin (0.05 mg/ml)], na kisha kusaga njia hiyo katika papain [HBSS, ikiongezewa 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) na deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Tibu kwa dakika 30 kwa 30°C. Kwanza osha tishu kwenye kiyoyozi cha HBSS chenye kamasi ya yai (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) na DNase (0.1 mg/ml) kwenye joto la kawaida ili kuzuia usagaji wa kimeng'enya, na kisha kwenye kiyoyozi cha HBSS chenye glukosi ya 20 mM. Saga kwa upole kwenye seli moja za HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) na DNase (0.1 mg/ml). Kiyoyozi kilichotolewa kilichujwa kupitia kichujio cha seli cha 70μm, kisha seli zilichujwa kwa kutumia centrifugation (1110 rpm, dakika 5, 4°C) na kusimamishwa tena kwenye kiyoyozi cha kupanga [HBSS, iliyoongezewa glukosi ya 20 mM, ng'ombe wa fetasi 20%). Seramu, penicillin (50 U/ml) na streptomycin (0.05 mg/ml)]; tathmini uwezo wa seli kuishi kwa propidium iodide na urekebishe msongamano wa seli hadi seli 1×106 hadi 2×106/ml. Kabla ya saitometri ya mtiririko, kusimamishwa kulichujwa kupitia kichujio cha seli cha 50 μm.
Saitomita ya mtiririko. Upangaji wa seli ulifanywa kwa 4°C kwa kutumia mashine ya FACSAria III (BD Biosciences) na programu ya FACSDiva (BD Biosciences, toleo la 8.0.1). Usimamishaji wa seli ulipangwa kwa kutumia pua ya 100 μm chini ya shinikizo la psi 20 kwa kiwango cha ~2800 matukio/sekunde. Kwa kuwa vigezo vya jadi vya upangaji (ukubwa wa seli, ubaguzi wa bimodal, na sifa za kutawanyika) haviwezi kuhakikisha utengano sahihi wa PN kutoka kwa aina zingine za seli, mkakati wa upangaji umewekwa kulingana na ulinganisho wa moja kwa moja wa nguvu ya YFP na fluorescence otomatiki katika mitoYFP+ ​​​​na mitoYFP − Panya wa kudhibiti. YFP husisimka kwa kuangazia sampuli kwa kutumia mstari wa leza wa 488 nm, na ishara hugunduliwa kwa kutumia kichujio cha kupitisha bendi cha 530/30 nm. Katika mitoYFP+, nguvu ya jamaa ya jeni la mwandishi wa Rosa26-mitoYFP pia hutumika kutofautisha vipande vya mwili wa neva na aksoni. 7-AAD inasisimuliwa na leza ya manjano ya 561 nm na kugunduliwa kwa kutumia kichujio cha bandpass cha 675/20 nm ili kuondoa seli zilizokufa. Ili kutenganisha astrosaiti kwa wakati mmoja, kusimamishwa kwa seli kulitiwa rangi ya ACSA-2-APC, kisha sampuli ilimwagiliwa na mstari wa leza wa 640 nm, na kichujio cha bandpass cha 660/20 nm kilitumika kugundua ishara.
Seli zilizokusanywa zilichujwa kwa kutumia centrifugation (1110 rpm, dakika 5, 4°C) na kuhifadhiwa kwa -80°C hadi zitumike. Panya wa Mfn2cKO na watoto wao wa mbwa huainishwa siku hiyo hiyo ili kupunguza utofauti wa kiutaratibu. Uwasilishaji na uchambuzi wa data ya FACS ulifanywa kwa kutumia programu ya FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Marekani).
Kama ilivyotajwa hapo juu (59), PCR ya wakati halisi hutumika kutenganisha DNA kutoka kwa niuroni zilizopangwa kwa ajili ya upimaji unaofuata wa mtDNA. Usikivu wa mstari na kizingiti ulijaribiwa awali kwa kuendesha qPCR kwenye idadi tofauti ya seli. Kwa kifupi, kukusanya 300 PN katika bafa ya lysis yenye 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Kati ya 20 na proteinase K (200 ng/ml) na kuanguliwa kwa 55°C kwa dakika 120. Seli zilianguliwa zaidi kwa 95°C kwa dakika 10 ili kuhakikisha kuachishwa kabisa kwa proteinase K. Kwa kutumia probe ya TaqMan (Thermo Fisher) maalum kwa mt-Nd1, mtDNA ilipimwa kwa PCR ya kiasi kidogo katika mfumo wa 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Sayansi, nambari ya katalogi Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nambari ya katalogi AIVI3E8) na jeni 18S (Thermo Fisher Scientific, nambari ya katalogi Hs99999901_s1).
Maandalizi ya sampuli ya proteome. Kwa kupasha joto mchanganyiko kwenye 95°C kwa dakika 10 na kuutia sonicating, kwenye kihifadhi cha lysis [6 M guanidine kloridi, 10 mM tris(2-carboxyethyl) fosfini hidrokloridi, 10 mM chloroacetamide na 100 mM tris-Lyse chembechembe za niuroni zilizogandishwa katika HCl]. Kwenye Bioruptor (Diagenode) kwa dakika 10 (sekunde 30 za mpigo / sekunde 30 za kipindi cha mapumziko). Sampuli ilipunguzwa maji kwa 1:10 katika 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ikichanganywa na 300 ng trypsin gold (Promega), na kuwekwa kwenye incubation usiku kucha kwa 37°C ili kufikia usagaji kamili. Siku ya pili, sampuli iliwekwa kwenye centrifuge kwa 20,000 g kwa dakika 20. Supernatant ilipunguzwa maji kwa asidi fomik 0.1%, na mchanganyiko huo uliondolewa chumvi kwa StageTips zilizotengenezwa na wewe mwenyewe. Sampuli ilikaushwa kwenye kifaa cha SpeedVac (kikontena cha Eppendorf pamoja na 5305) kwa joto la 45°C, na kisha peptidi ilisimamishwa katika asidi fomi ya 0.1%. Sampuli zote zilitayarishwa kwa wakati mmoja na mtu yule yule. Ili kuchanganua sampuli za astrosaiti, peptidi 4 μg zilizoondolewa chumvi ziliwekwa lebo ya wingi wa sanjari (TMT10plex, nambari ya katalogi 90110, Thermo Fisher Scientific) zenye uwiano wa peptidi hadi kitendanishi cha TMT wa 1:20. Kwa uwekaji lebo wa TMT, 0.8 mg ya kitendanishi cha TMT ilisimamishwa tena katika 70 μl ya ACN isiyo na maji, na peptidi iliyokaushwa iliunganishwa tena katika 9 μl ya 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), ambayo 7 μl ya kitendanishi cha TMT katika ACN iliongezwa. Kiwango kilikuwa 43.75%. Baada ya dakika 60 za kuanguliwa, mmenyuko ulizimwa kwa 2 μl ya hidroksilamini 5%. Peptidi zilizoandikwa zilikusanywa, zikaushwa, zikaushwa tena katika 200μl ya asidi fomiksi 0.1% (FA), zikagawanywa katika sehemu mbili, na kisha zikaondolewa chumvi kwa kutumia StageTips zilizotengenezwa na wewe mwenyewe. Kwa kutumia chromatografi ya kioevu ya UltiMate 3000 yenye utendaji wa hali ya juu (chromatografi ya kioevu ya UltiMate 3000 yenye utendaji wa hali ya juu), moja ya nusu hizo mbili iligawanywa katika safu wima ya chromatografi ya Acquity ya 1mm x 150mm iliyojazwa chembe chembe za C18 za 130Å1.7μm (Waters, catalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Tenganisha peptidi kwa kiwango cha mtiririko cha 30μl/dakika, tenganisha na 1% hadi 50% ya bafa B kwa dakika 85 na mteremko wa hatua kwa hatua wa dakika 96, kutoka 50% hadi 95% ya bafa B kwa dakika 3, kisha dakika 8 kwa 95% ya Bafa B; Bafa A ni 5% ACN na 10 mM ammonium bikaboneti (ABC), na bafa B ni 80% ACN na 10 mM ABC. Kusanya vipande kila baada ya dakika 3 na uvichanganye katika vikundi viwili (1 + 17, 2 + 18, nk) na uvikaushe kwenye centrifuge ya utupu.
Uchambuzi wa LC-MS/MS. Kwa spektrometri ya wingi, peptidi (nambari r119.aq) zilitenganishwa kwenye safu wima ya uchambuzi ya PicoFrit yenye kipenyo cha ndani cha sentimita 25, 75 μm (lenzi mpya ya lengo, nambari ya sehemu PF7508250) iliyo na 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mkeka), Tumia EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Ujerumani). Safu ilidumishwa kwa 50°C. Vizuizi A na B ni asidi fomik 0.1% katika maji na asidi fomik 0.1% katika 80% ACN, mtawalia. Peptidi zilitenganishwa kutoka 6% hadi 31% ya bafa B kwa dakika 65 na kutoka 31% hadi 50% ya bafa B kwa dakika 5 kwa mteremko wa 200 nl/min. Peptidi zilizoepukwa zilichambuliwa kwenye spektrometa ya wingi ya Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Kipimo cha m/z cha mtangulizi wa peptidi hufanywa kwa azimio la 120,000 katika kiwango cha 350 hadi 1500 m/z. Kwa kutumia nishati ya mgongano ya kawaida ya 27%, mtangulizi mwenye nguvu zaidi mwenye hali ya chaji ya 2 hadi 6 huchaguliwa kwa mgawanyiko wa mtego wa C wenye nguvu nyingi (HCD). Muda wa mzunguko umewekwa kwa sekunde 1. Thamani ya m/z ya kipande cha peptidi ilipimwa katika mtego wa ioni kwa kutumia shabaha ndogo zaidi ya AGC ya 5×104 na muda wa juu zaidi wa sindano wa 86 ms. Baada ya kugawanyika, mtangulizi aliwekwa kwenye orodha ya kutengwa kwa nguvu kwa sekunde 45. Peptidi zenye lebo ya TMT zilitenganishwa kwenye safu wima ya Acclaim PepMap ya sentimita 50, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nambari ya katalogi 164942), na spektromu za uhamiaji zilichambuliwa kwenye spektromu ya molekuli ya Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) iliyo na vifaa vya ioni za umbo la wimbi lisilo na ulinganifu wa uwanja wa juu (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) hufanya kazi kwa volteji mbili za fidia za -50 na -70 V. MS3 iliyochaguliwa kulingana na kitangulizi cha ulandanishi kinachotumika kwa kipimo cha ishara ya ioni ya ripoti ya TMT. Utenganishaji wa peptidi ulifanyika kwenye EASY-nLC 1200, kwa kutumia uondoaji wa gradient wa mstari wa 90%, na mkusanyiko wa buffer wa 6% hadi 31%; buffer A ilikuwa 0.1% FA, na buffer B ilikuwa 0.1% FA na 80% ACN. Safu wima ya uchanganuzi inaendeshwa kwa 50°C. Tumia FreeStyle (toleo la 1.6, Thermo Fisher Scientific) kugawanya faili asili kulingana na volteji ya fidia ya FAIMS.
Utambuzi na upimaji wa protini. Kwa kutumia injini ya utafutaji iliyojumuishwa ya Andromeda, data asili ilichambuliwa kwa kutumia toleo la MaxQuant 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Mbali na mfuatano wa Cre recombinase na YFP uliopatikana kutoka Aequorea victoria, spektra za vipande vya peptidi zilitafutwa kwa mfuatano wa kisheria na mfuatano wa isoform wa proteome ya marejeleo ya panya (Proteome ID UP000000589, iliyopakuliwa kutoka UniProt mnamo Mei 2017). Oxidation ya methionine na asetili ya protini N-terminal ziliwekwa kama marekebisho yanayobadilika; methylation ya cysteine ​​​​carbamoyl iliwekwa kama marekebisho yasiyobadilika. Vigezo vya usagaji vimewekwa kwa "umaalum" na "trypsin/P". Idadi ya chini kabisa ya peptidi na peptidi za wembe zinazotumika kwa utambulisho wa protini ni 1; idadi ya chini kabisa ya peptidi za kipekee ni 0. Chini ya masharti ya ulinganishaji wa ramani ya peptidi, kiwango cha utambulisho wa protini kilikuwa 0.01. Chaguo la "Peptidi ya Pili" limewezeshwa. Tumia chaguo la "kulinganisha kati ya utendakazi" ili kuhamisha utambulisho uliofanikiwa kati ya faili tofauti asilia. Tumia hesabu ya uwiano wa chini kabisa wa LFQ 1 kwa upimaji usio na lebo (LFQ) (60). Kiwango cha LFQ huchujwa kwa angalau thamani mbili halali katika angalau kundi moja la jeni katika kila nukta ya wakati, na hutolewa kutoka kwa usambazaji wa kawaida wenye upana wa 0.3 na kusogea chini 1.8. Tumia jukwaa la kompyuta la Perseus (https://maxquant.net/perseus/) na R (https://r-project.org/) kuchanganua matokeo ya LFQ. Jaribio la wastani la njia mbili kutoka kwa kifurushi cha programu ya limma lilitumika kwa uchanganuzi wa usemi tofauti (61). Uchanganuzi wa data ya uchunguzi unafanywa kwa kutumia ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally na pheatmap. Data ya proteomics inayotegemea TMT ilichanganuliwa kwa kutumia toleo la MaxQuant 1.6.10.43. Tafuta data ghafi ya proteomics kutoka kwa hifadhidata ya proteomics ya binadamu ya UniProt, ambayo ilipakuliwa mnamo Septemba 2018. Uchambuzi huu unajumuisha kipengele cha urekebishaji wa usafi wa isotopu kilichotolewa na mtengenezaji. Tumia limma katika R kwa uchanganuzi wa usemi tofauti. Data asilia, matokeo ya utafutaji wa hifadhidata, na mtiririko wa kazi wa uchanganuzi wa data na matokeo yote yamehifadhiwa katika muungano wa ProteomeXchange kupitia hazina ya washirika wa PRIDE yenye kitambulisho cha seti ya data PXD019690.
Maelezo ya utendaji huimarisha uchanganuzi. Zana ya Uchanganuzi wa Njia ya Ujanja (QIAGEN) ilitumika kubaini utajiri wa masharti ya maelezo ya utendaji ya data iliyowekwa katika wiki 8 (Mchoro 1). Kwa kifupi, orodha ya protini ya kiasi iliyopatikana kutoka kwa uchanganuzi wa data wa LC-MS/MS (spectrometry ya wingi sanjari) inatumika kwa vigezo vifuatavyo vya kichujio: Mus musculus imechaguliwa kama spishi na usuli, na kategoria inaonyesha thamani ya P iliyorekebishwa na Benjamini kwa ajili ya utajiri wa 0.05 au chini inachukuliwa kuwa muhimu. Kwa grafu hii, kategoria tano za juu za ziada katika kila nguzo kulingana na thamani ya P iliyorekebishwa zinaonyeshwa. Kwa kutumia jaribio nyingi la t, kwa kutumia programu ya kuongeza mstari ya hatua mbili ya Benjamini, Krieger, na Yekutieli (Q = 5%), uchanganuzi wa usemi wa protini ya mwendo wa wakati hufanywa kwa wagombea muhimu waliotambuliwa katika kila kategoria, na kila safu inachambuliwa kando. Hakuna haja ya kupitisha SD thabiti.
Ili kulinganisha matokeo ya utafiti huu na hifadhidata zilizochapishwa na kutoa mchoro wa Venn katika Mchoro 1, tuliunganisha orodha ya protini ya kiasi na maelezo ya MitoCarta 2.0 (24). Tumia zana ya mtandaoni ya Chora Mchoro wa Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ili kutoa mchoro.
Kwa maelezo ya kina kuhusu taratibu za takwimu zinazotumika kwa uchambuzi wa proteomics, tafadhali rejelea sehemu inayolingana ya Nyenzo na Mbinu. Kwa majaribio mengine yote, maelezo ya kina yanaweza kupatikana katika hadithi inayolingana. Isipokuwa kama imeainishwa vinginevyo, data yote imeonyeshwa kama wastani ± SEM, na uchambuzi wote wa takwimu ulifanywa kwa kutumia programu ya GraphPad Prism 8.1.2.
Kwa nyenzo za ziada kwa makala haya, tafadhali tazama http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Hii ni makala ya ufikiaji wazi inayosambazwa chini ya masharti ya Leseni ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, ambayo inaruhusu matumizi, usambazaji na uzandikishaji katika njia yoyote, mradi tu matumizi ya mwisho si kwa faida ya kibiashara na msingi ni kwamba kazi ya awali ni sahihi. Marejeleo.
Kumbuka: Tunakuomba tu utoe anwani yako ya barua pepe ili mtu unayempendekeza kwenye ukurasa ajue kwamba unataka aone barua pepe hiyo na kwamba si barua taka. Hatutarekodi anwani zozote za barua pepe.
Swali hili linatumika kujaribu kama wewe ni mgeni na kuzuia uwasilishaji wa barua taka kiotomatiki.
Na E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Uchambuzi wa proteomics wa niuroni zisizofanya kazi vizuri ulionyesha kuwa programu za kimetaboliki huamilishwa ili kukabiliana na kuzorota kwa neva.
Na E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Uchambuzi wa proteomics wa niuroni zisizofanya kazi vizuri ulionyesha kuwa programu za kimetaboliki huamilishwa ili kukabiliana na kuzorota kwa neva.
©2020 Chama cha Marekani cha Kuendeleza Sayansi. haki zote zimehifadhiwa. AAAS ni mshirika wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef na COUNTER. SayansiMaendeleo ISSN 2375-2548.