Anwani ya sasa: OX11 0DE, Uingereza, Jengo la Diamond, Hifadhi ya Sayansi na Ubunifu ya Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Uingereza, Diamond Light Source Co., Ltd., Kituo cha Upigaji Picha cha Kielektroniki cha Biolojia.
Kiungo cha uvunaji mwanga cha kituo cha mmenyuko 1 (RC-LH1) ndicho sehemu kuu ya usanisinuru ya bakteria ya zambarau ya phototrophic. Tulianzisha miundo miwili ya hadubini ya cryo-elektroni ya kiunganishi cha RC-LH1 kutoka kwa Rhodopseudomonas palustris. Muundo wa azimio la 2.65-Å wa kiunganishi cha RC-LH114-W una vitanzi 14 vya LH1 vya kitengo kidogo vinavyozunguka RC, ambavyo huingiliwa na protini W, huku kiunganishi kisicho na protini-W kikiwa kimezungukwa na RC kabisa. Kitanzi cha LH1 cha kitengo kidogo 16 kimefungwa. Ulinganisho wa miundo hii hutoa ufahamu kuhusu mienendo ya quinone katika kiunganishi cha RC-LH1, ikiwa ni pamoja na mabadiliko ya umbo ambayo hayajabainishwa hapo awali wakati wa kufunga quinone kwenye tovuti ya RC QB, pamoja na eneo la maeneo saidizi ya kufunga quinone, ambayo husaidia kuyapitisha kwa RC. Muundo wa kipekee wa protini ya W huzuia kufungwa kwa kitanzi cha LH1, na hivyo kuunda njia ya kuharakisha ubadilishanaji wa quinone/quinolone.
Nishati inayotolewa na usanisinuru inaweza kudumisha karibu maisha yote duniani, na ina uwezo mkubwa wa bayoteknolojia ya jua. Wakati ikikuza usanisinuru wa kimataifa, bakteria wa usanisinuru wa zambarau pia huonyesha njia mbalimbali za nishati na uwezo wa kimetaboliki. Wanaweza kuepuka usanisinuru na kukua huku bakteria wa usanisinuru wakiwa gizani, wanaweza kurekebisha nitrojeni na dioksidi kaboni, kutoa hidrojeni, na kuharibu misombo ya kunukia (1-3). Ili kutoa nishati kwa michakato hii, mwanga lazima ubadilishwe haraka na kwa ufanisi kuwa nishati ya kemikali. Mchakato huu huanza wakati antena tata ya kukamata mwanga inachukua mwanga na kuhamisha nishati iliyonaswa hadi kituo cha mmenyuko (RC), na hivyo kuanza utenganisho wa chaji (4-7). Kitengo cha msingi cha usanisinuru katika bakteria wa usanisinuru wa zambarau kinaundwa na aina ya RC ya aina ya 2, iliyozungukwa na mchanganyiko wa uvunaji mwanga 1 (LH1), na kutengeneza mchanganyiko wa kiini cha RC-LH1. LH1 huundwa na safu ya heterodimers za αβ zilizopinda, ambazo kila moja hufunga klorofili mbili za bakteria (BChl) molekuli na karotenoidi moja au mbili (8-12). Antena rahisi zaidi ya LH1 ina heterodimer 16 au 17 za αβ zinazozunguka RC (9-13) katika kitanzi kilichofungwa, lakini katika miundo mingine ya msingi, peptidi za transmembrane hukatiza mwendelezo wa LH1 inayozunguka, na hivyo kukuza uenezaji wa quinol/quinone kati ya RC na tata ya saitokromu bc1 (11, 13-15). Mmea wa zambarau wa fototrofiki Rhodopseudomonas (Rps.) ni kiumbe cha mfano kinachoweza kuelewa nishati na uhamishaji wa elektroni unaounga mkono usanisinuru. Muundo wa kwanza wa fuwele wa Rps. Mfano wa tata ya palustris RC-LH1 ni RC, iliyozungukwa na mizunguko 15 ya heterodimeric LH1, ambayo huingiliwa na protini isiyojulikana inayoitwa "Protini W" (14). Protini-W baadaye ilitambuliwa kama RPA4402, ambayo ni protini isiyo na sifa ya 10.5kDa yenye helikopta tatu za transmembrane zilizotabiriwa (TMH) (16). Tunapendekeza kubadilisha jina la jeni la rpa4402 linalosimba protini W kuwa pufW ili liendane na majina yanayotumika kwa jeni zinazosimba RC-L, M (pufL, pufM) na LH1α, β (pufA, pufB). Cha kufurahisha ni kwamba, protini-W inapatikana tu katika takriban 10% ya RC-LH1, na kufichua kwamba Rps. palustris hutoa michanganyiko miwili tofauti ya RC-LH1. Hapa, tunaripoti miundo ya cryo-EM (cryo-EM) yenye ubora wa juu wa michanganyiko miwili ya msingi, moja ikiwa na protini W na heterodimers 14 za αβ, nyingine bila protini W na kitanzi kilichofungwa cha Heterodimer LH1 16. Muundo wetu unawakilisha mabadiliko ya hatua katika uelewa wa mchanganyiko wa RC-LH1 wa Rps. palustris, kwa sababu tumechambua idadi ya watu sawa ya kila aina na tuna azimio la kutosha kugawa wazi kila peptidi na rangi zilizofungwa na lipidi na kwinoni zinazohusiana. Ulinganisho wa miundo hii unaonyesha kwamba protini tatu za TMH-W ambazo hazijapatikana katika mchanganyiko mwingine wowote wa RC-LH1 hadi sasa hutoa njia ya quinone ili kuharakisha ubadilishanaji wa quinone/quinolone. Sehemu kadhaa za uunganishaji wa lipidi na quinone zilizohifadhiwa zimetambuliwa, na tumefichua mabadiliko mapya ya umbo baada ya mchanganyiko wa quinone na RC, ambayo inaweza kufaa kwa RC ya mfumo wa picha II (PSII) ya viumbe vya fototropiki vilivyo na oksijeni. Matokeo yetu yanatoa ufahamu mpya kuhusu kinetiki ya uunganishaji na ubadilishanaji wa quinone/quinolone katika mchanganyiko wa msingi wa RC-LH1 wa bakteria ya zambarau ya fototropiki.
Ili kurahisisha utafiti wa kina wa vijenzi viwili vinavyopatikana katika Rps. palustris, tunatenganisha kila RC-LH1 kwa njia za kibiokemikali. Kijenzi chenye upungufu wa protini W (hapa kitajulikana kama ΔpufW) kilisafishwa kutoka kwa kijenzi kisicho na jeni la pufW (16), na kijenzi kimoja tu cha RC-LH1 kinaweza kuzalishwa. Kijenzi chenye protini W huzalishwa na kijenzi. Protini W ya kijenzi hiki hubadilishwa na lebo ya His mara 10 kwenye mwisho wake wa C, ili kijenzi chenye protini W kiweze kuunganishwa kwa ufanisi na kijenzi W nyingi kisicho na protini kwa kuzuia metali. Kijenzi kimetenganishwa kwa ufanisi (16) Kromatografia ya Uhusiano (IMAC).
Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1, miundo yote miwili ina RC ndogo tatu (RC-L, RC-M na RC-H) iliyozungukwa na antena ya LH1. Muundo wa 2.80-A wa tata isiyo na protini-W unaonyesha heterodimers 16 za αβ, na kutengeneza kitanzi kilichofungwa cha LH1 kinachozunguka kabisa RC, ambacho kitajulikana kama tata ya RC-LH116. Muundo wa 2.65Å wa tata iliyo na protini-W una LH1 ya heterodimer 14 iliyoingiliwa na protini-W, ambayo itajulikana kama RC-LH114-W.
(A na B) Uwakilishi wa uso wa kiwanja. (C na D) Rangi zilizounganishwa zilizoonyeshwa kwenye fimbo. (E na F) Maumbile yanayoonekana kutoka kwenye uso wa saitoplazimu yana peptidi na vijiti vidogo vya LH1 vinavyowakilishwa katika katuni, na huhesabiwa kwa njia ya saa kutoka kwa pengo la protini-W [linaloendana na nambari za Rba. sphaeroides complex (13)]. Kwa LH1-α, rangi ya kijiti kidogo cha protini ni njano; kwa LH1-β, rangi ya kijiti kidogo cha protini ni bluu; kwa protini-W, protini ni nyekundu; kwa RC-H, ni cyan; kwa RC-L, ni Chungwa; kwa RC-M, magenta. Viambatanishi vinawakilishwa na fimbo, kijani kinawakilisha BChl na BPh molekuli, zambarau inawakilisha karotenoidi, na njano inawakilisha molekuli za UQ10. (G na H) Mtazamo uliokuzwa wa pengo la protini-W katika eneo sawa la kijiti cha RC-LH114-W (G) na kijiti cha RC-LH116 (H). Viambatanishi huonyeshwa katika mfumo wa kujaza nafasi, quinone iliyochongoka huonyeshwa kwa rangi ya bluu. Pengo la protini-W huangaziwa na mstari wa bluu ulio na mistari katika (G), na mashimo madogo ambapo quinone/quinolol huenea kwenye pete ya LH116 huangaziwa na mstari mweusi ulio na mistari katika (H).
Mchoro 1 (A na B) unaonyesha RC iliyozungukwa na safu zilizo wazi au zilizofungwa za heterodimers za LH1αβ, ambazo kila moja hufunga BChl mbili na carotenoid moja (Mchoro 1, C na D). Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa Rps ni mchanganyiko wa LH1. Katika njia ya kibiolojia ya spirulina xanthin, spishi hizi zina idadi mchanganyiko ya carotenoids (17). Hata hivyo, spiropyrroxanthin ndiyo carotenoid inayotawala na msongamano wake unatosha. Kwa hivyo, tulichagua kuiga spiroxanthin katika maeneo yote ya kufungamana ya LH1. Polipoptidi za alpha na beta ni TMH moja zenye maeneo mafupi ya nje ya utando (Mchoro 1, A, B, E, na F). Ingawa msongamano wa mabaki 17 kwenye C-terminus haukuonekana, polipeptidi ya alpha ilikatwa kutoka Met1 hadi Ala46 katika michanganyiko yote miwili. β polipeptidi ilipunguzwa kutoka Gly4 hadi Tyr52 katika RC-LH116, na kutoka Ser5 hadi Tyr52 katika RC-LH114-W. Hakuna msongamano wa mabaki ya N-terminal 3 au 4 au C-terminal 13 yaliyoonekana (Mchoro S1). Uchambuzi wa spektrometri ya wingi wa mchanganyiko wa RC-LH1 ulioandaliwa kutoka kwa aina ya porini ulionyesha kuwa eneo lililokosekana lilikuwa matokeo ya mgawanyiko wa heterologous wa peptidi hizi (Mchoro S1 na S2). Uundaji wa N-terminal wa α-Met1 pia ulizingatiwa (f). Uchambuzi ulionyesha kuwa α-peptidi ina mabaki fMet1 hadi Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, na β-peptidi ina mabaki Ser2 hadi Ala53, ambayo yanakubaliana vyema na ramani ya msongamano wa EM ya halijoto ya chini.
Uratibu wa α-His29 na β-His36 hufanya BChls ana kwa ana; kila heterodimer ya αβ hukusanyika na majirani zake ili kuunda kitanzi wazi (RC-LH114-W) au kitanzi kilichofungwa (RC-LH116) kuzunguka RC. Safu ya rangi iliyounganishwa na exciton (Mchoro 1, C na D). Ikilinganishwa na bendi ya 877 nm ya RC-LH114-W, mabadiliko ya rangi nyekundu ya ufyonzaji wa 880 nm ya RC-LH116 ni 3 nm (Mchoro 2A). Hata hivyo, wigo wa dichroism wa duara ni karibu sawa (Mchoro 2B), ikionyesha kwamba ingawa kuna tofauti dhahiri kati ya vitanzi vilivyo wazi na vilivyofungwa, mazingira ya ndani ya BChls yanafanana sana. Mabadiliko ya rangi nyekundu ya ufyonzaji yanaweza kuwa matokeo ya mwendo mdogo wa joto na utulivu ulioongezeka kwenye kitanzi kilichofungwa (18, 19), mabadiliko katika muunganisho wa rangi unaosababishwa na kitanzi kilichofungwa (20, 21), au mchanganyiko wa athari hizi mbili (11).
(A) Wigo wa unyonyaji wa Mionzi ya Ultraviolet/inayoonekana/karibu na infrared, vilele vyake vimewekwa alama na rangi zinazolingana na kurekebishwa hadi kilele cha BPh kwenye nm 775. (B) Wigo wa dichroism wa duara umerekebishwa hadi unyonyaji wa BChl kwenye nm 805. (C na D) Spektra ya ΔA iliyochaguliwa kutoka kwa spktra ya unyonyaji iliyotatuliwa kwa wakati ya RC-LH114-W tata (C) na RC-LH116 tata (D). Kwa ulinganisho bora, spktra zote hurekebishwa hadi ∆A ya −A kwa 0.2 ps. (E) Kiwango cha oksidi ya saitokromu c2 baada ya kuangaziwa mbele ya viwango mbalimbali vya UQ2 (tazama Mchoro S8 kwa data ghafi). (F) Katika seli zilizokua chini ya mwanga mdogo, wa kati au wa kiwango cha juu (10, 30 au 300μMm-2 s-1, mtawalia), protini W na RC-L hutenganishwa katika kiwanja kilichosafishwa na uwiano wa utando uliotengwa. Tambua kiwango cha protini kwa kutumia elektrophoresis ya jeli ya SDS-polyacrylamide na kipimo cha kinga mwilini (tazama Mchoro S9 kwa data ghafi). Tambua uwiano unaohusiana na mchanganyiko wa RC-LH114-W uliosafishwa. Uwiano wa stoichiometric wa RC-L kwa protini-W ya mchanganyiko ni 1:1.
BChl katika nafasi ya 1 katika kitanzi cha αβ14 kilichoharibika cha RC-LH114-W (Mchoro 1, A, C, na E) ziko karibu na mtoaji mkuu wa RC (P) kwa 6.8Å kuliko BChls sawa katika RC-LH116 (Mchoro 1, B, D, na F, na Mchoro S3); hata hivyo, kinetiki ya unyonyaji wa muda mfupi wa tata hizo mbili inaonyesha kwamba kwa RC-LH114-W na RC-LH116, vigeu vya muda wa uhamisho wa nishati ya msisimko kutoka LH1 hadi RC ni 40 ±4 na 44±3 ps (Mchoro 2). , C na D, Mchoro S4 na Jedwali S2). Pia hakuna tofauti kubwa katika uhamisho wa kielektroniki ndani ya RC (Mchoro S5 na maandishi ya ziada yanayohusiana). Tunashuku kwamba uhusiano wa karibu wa muda wa uhamisho wa nishati kati ya LH1 na RC-P unatokana na umbali sawa, pembe na nishati inayowezekana ya BChl nyingi katika vitanzi viwili vya LH1. Inaonekana kwamba kuchunguza muundo wa nishati ya LH1 ili kufikia umbali wa chini kabisa si haraka kuliko uhamisho wa nishati ya moja kwa moja kutoka maeneo yasiyofaa hadi RC. Kitanzi cha LH1 cha kitanzi wazi katika RC-LH114-W kinaweza pia kupitia mwendo mdogo wa joto chini ya hali ya joto la chini kwa ajili ya uchambuzi wa kimuundo, na kuna umbo refu zaidi la pete ya αβ14 kwenye joto la kawaida kutoka umbali wa rangi wa βBChls katika nafasi ya RC 1.
Mchanganyiko wa RC-LH116 una BChls 32 na karotenoidi 16, na mpangilio wake kwa ujumla ni sawa na ule uliopatikana kutoka kwa Thermochromatium (Tch.) pipidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) aina ya 970 (PDB ID 7C9R) (12) na mwani wa kijani (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Baada ya mpangilio, ni tofauti ndogo tu katika nafasi za heterodimers za αβ zilizoonekana, haswa 1-5, 15, na 16 (Mchoro S6). Uwepo wa protini-W una athari kubwa kwenye muundo wa LH1. TMH zake tatu zimeunganishwa na vitanzi vifupi, huku N-terminal ikiwa upande wa lumen wa mchanganyiko na C-terminal ikiwa upande wa saitoplazimu (Mchoro 1A na 3, A hadi D). Protini-W kwa kiasi kikubwa hugandamana na maji (Mchoro 3B), na TMH2 na TMH3 huingiliana na LH1αβ-14 ili kuunda uso wa utando (Mchoro 3, B na E hadi G). Kiungo hiki kinaundwa zaidi na mabaki ya Phe, Leu na Val katika eneo la utando. Mabaki haya yamerundikwa na amino asidi za hidrofobi na rangi za αβ-14. Baadhi ya mabaki ya polar pia huchangia katika mwingiliano, ikiwa ni pamoja na dhamana ya hidrojeni kati ya W-Thr68 na β-Trp42 kwenye uso wa uwazi tata (Mchoro 3, F na G). Kwenye uso wa saitoplazimu, Gln34 iko karibu na kundi la keto la karotenoidi za αβ-14. Zaidi ya hayo, molekuli ya n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ilitatuliwa, na mkia wake wa hidrofobi ulienea hadi kwenye kiungo kati ya protini-W na αβ-14, na mkia wa lipidi unaweza kuwa mwilini. Pia tuligundua kuwa maeneo ya azimio la C-terminal ya protini W na RCH yako karibu sana, lakini si ndani ya wigo wa kuunda mwingiliano maalum (Mchoro 1, A na E). Hata hivyo, kunaweza kuwa na mwingiliano katika asidi amino za C-terminal ambazo hazijatatuliwa za protini hizi mbili, ambazo zinaweza kutoa utaratibu wa kuajiri protini-W wakati wa mkusanyiko wa RC-LH114-W.
(A) Protini-W, ambayo inakabiliwa na kiolesura na LH1αβ14 katika umbo la katuni, ina mnyororo wa pembeni wenye umbo la fimbo (nyekundu), unaoonyeshwa katika sehemu ya mchoro wa uwezo wa umemetuamo (uso wa kijivu ulio wazi wenye kiwango cha kontua cha 0.13). (B) Protini-W inayowakilishwa na uso wenye rangi ya haidrofobi. Maeneo ya polar na yaliyochajiwa yanaonyeshwa katika sarani, maeneo ya haidrofobi yanaonyeshwa katika nyeupe, na maeneo yenye haidrofobi sana yanaonyeshwa katika rangi ya chungwa. (C na D) Protini-W inayowakilishwa katika katuni, mwelekeo wake ni sawa na katika (A) (C), na huzungushwa kwa 180° (D). Kulingana na nafasi katika mfuatano, mabaki yanayoweza kutofautishwa huchukua mpango wa rangi ya upinde wa mvua, ambapo N-terminal ni bluu na C-terminal ni nyekundu. (E) Protini-W katika mwonekano sawa na katika (A), na mabaki kwenye kiolesura cha protini-W:LH1 yanawakilishwa na fimbo zenye alama zilizounganishwa. (F) Protini-W huzungushwa 90° ikilinganishwa na (E) na LH1αβ14 katika uwakilishi wa katuni, na ikilinganishwa na mabaki ya kiolesura katika uwakilishi wa upau. Mabaki yanayoning'inia kutoka kwa polipeptidi ya beta yamebandikwa lebo. Kitendakazi kinaonyeshwa kama upau unaolingana na rangi ya Mchoro 1, β-DDM iliyooza inaonyeshwa kwa kijivu, na oksijeni inaonyeshwa kwa nyekundu. (G) Mwonekano katika (F) umezungushwa 180°, pamoja na mabaki yanayoonekana ya polipeptidi ya alpha yenye lebo.
Protini-W inachukua nafasi ya heterodimer ya αβ (ya 15 katika Mchoro 1F), na hivyo kuzuia kufungwa kwa kitanzi na kuinamisha heterodimer tatu za kwanza za αβ. Ilibainika kuwa pembe ya juu zaidi ya mwelekeo wa heterodimer ya kwanza ya αβ-1 ikilinganishwa na filamu ya kawaida ilikuwa 25° hadi 29° (Mchoro 1, A na E), ambayo iliundwa na mwelekeo wa 2° hadi 8° wa αβ-1 katika RC A tofauti kali-LH116 (Mchoro 1, B na F). Heterodimer ya pili na ya tatu imeinama kwa 12° hadi 22° na 5° hadi 10°, mtawalia. Kutokana na kizuizi cha steric cha RC, mwelekeo wa αβ-1 haujumuishi jozi ya pili ya αβ (ambayo inalingana na αβ ya 16 katika Mchoro 1F), hivyo kutengeneza pengo wazi katika pete ya LH1 (Mchoro 1, A na E). Kutokana na ukosefu wa heterodimer mbili za αβ, zinazoambatana na upotevu wa BChl nne na karotenoidi mbili, hakuna karotenoidi yoyote inayofungamana na kitengo kidogo cha αβ-1 kilichopotoka, na kusababisha pete ya LH114-W iliyo na karotenoidi 13 za Mboga na BChl 28. Makadirio ya azimio la ndani ya tata mbili katika maeneo ya αβ1 hadi 7 ni ya chini kuliko yale ya kitanzi kingine cha LH1, ambacho kinaweza kuonyesha unyumbufu wa asili wa kitengo kidogo cha LH1 kilicho karibu na eneo la RC QB (Mchoro 4).
Picha za RC-LH114-W (A na B) na RC-LH116 (C na D) zinaonyeshwa kutoka kwa mtazamo uleule wa juu/upande (A na B) (A na C) na uso wa tundu la Mchoro 1. (B na D). Funguo zenye rangi zinaonyeshwa upande wa kulia.
Kiini kingine pekee chenye sifa chenye uwiano wa stoichiometric wa 1:14 ni Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Hata hivyo, protini W na PufX hazina homolojia dhahiri, na zina athari kubwa kwenye miundo yao husika ya LH1. PufX ni TMH moja yenye kikoa cha saitoplazimu cha N-terminal ambacho huingiliana na upande wa saitoplazimu wa kitengo kidogo cha RC-H (13) katika nafasi inayolingana na Rps. palustris LH116αβ-16. PufX huunda njia ya ubadilishanaji wa quinone/quinolone kati ya RC-LH1 na saitokromu bcl tata na ipo katika tata yote ya msingi ya Rba. sphaeroides (13). Ingawa kiolesura cha monomer-monomer kiko katika Rba. Dimer ya sphaeroides RC-LH1-PufX iko katika nafasi ya kufungamana ya protini W katika RC-LH114-W, na pengo linalosababishwa na PufX na protini-W liko katika nafasi sawa (Mchoro S7A). Pengo katika RC-LH114-W pia linalingana na njia ya quinone ya kufikirika (8) ya Pseudomonas rosea LH1, ambayo huundwa na peptidi ambazo hazihusiani na protini W au PufX (Mchoro S7B). Kwa kuongezea, njia ya quinone katika Blc. LH1 ya kijani kibichi ya zumaridi iliyoundwa kwa kutenganisha kitengo kimoja cha γ (7) iko katika nafasi sawa (Mchoro S7C). Ingawa imesababishwa na protini tofauti, kuonekana kwa njia hizi za quinone/quinolol katika nafasi ya kawaida katika tata ya RC-LH1 inaonekana kuwa mfano wa mageuko yanayobadilika, kuonyesha kwamba pengo linaloundwa na protini W linaweza kutenda kama njia ya quinone.
Pengo katika kitanzi cha LH114-W huruhusu uundaji wa eneo la utando linaloendelea kati ya nafasi ya ndani ya tata ya RC-LH114-W na utando wa wingi (Mchoro 1G), badala ya kuunganisha vikoa hivyo viwili kupitia kinyweleo cha protini kama ilivyo katika protini. Mchanganyiko wa RC-LH116 unafanana na tata iliyofungwa kama Tch. (22) (Mchoro 1H). Kwa kuwa uenezaji wa quinone kupitia utando ni wa haraka kuliko uenezaji kupitia njia nyembamba ya protini, kitanzi kilicho wazi cha LH114-W kinaweza kuruhusu mzunguko wa RC wa haraka kuliko kitanzi kilichofungwa cha LH116, na uenezaji wa quinone ndani ya RC unaweza kuwa mdogo zaidi. Ili kujaribu kama protini W huathiri ubadilishaji wa quinone kupitia RC, tulifanya jaribio la oksidi ya saitokromu kwenye mkusanyiko fulani wa ubiquinone 2 (UQ2) (analojia ya UQ10 asilia yenye mkia mfupi wa isoprene) (Mchoro 2E). Ingawa uwepo wa quinone iliyochemshwa huzuia uamuzi sahihi wa kigezo cha Michaelis kinachoonekana (RC-LH114-W na RC-LH116 zinafaa kwa 0.2±0.1μM na 0.5±0.2μM, mtawalia), kiwango cha juu zaidi cha RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) ni kikubwa kwa 28±5% kuliko RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Hapo awali tulikadiria kwamba protini-W ipo katika takriban 10% ya kiini cha seli (16); hapa, viwango vya umiliki wa seli za ukuaji zenye mwanga mdogo, mwanga wa kati, na mwanga wa juu ni 15±0.6%, 11±1% na 0.9±0.5, mtawalia % (Mchoro 2F). Ulinganisho wa kiasi wa spektrometri ya wingi ulionyesha kuwa kuongezwa kwa lebo ya histidine hakukupunguza wingi wa protini-W ikilinganishwa na aina za aina ya mwitu (P = 0.59), kwa hivyo viwango hivi si bandia ya protini-W iliyorekebishwa (Mchoro S10). Hata hivyo, umiliki huu mdogo wa protini-W katika kiwanja cha RC-LH1 unaweza kuruhusu baadhi ya RC kugeuka kwa kasi ya kasi, na hivyo kupunguza ubadilishanaji wa polepole wa quinone/quinolone katika kiwanja cha RC-LH116. Tuligundua kuwa kiwango cha umiliki wa mwanga wa juu hakiendani na data ya hivi karibuni ya transcriptomics, ambayo inaonyesha kwamba usemi wa jeni la pufW huongezeka chini ya mwanga mkali (Mchoro S11) (23). Tofauti kati ya unukuzi wa pufW na ujumuishaji wa protini-W katika mchanganyiko wa RC-LH1 inachanganya na inaweza kuonyesha udhibiti tata wa protini.
Katika RC-LH114-W, molekuli 6 za cardiolipin (CDL), 7 za fosfatidilkolini (POPC), 1 ya fosfatidilglycerol (POPG) na 29 za β-DDM zimetengwa na kutengenezwa ndani yake, CDL 6, POPC 24, POPG 2 na 12 za βDDM. RC-LH116 (Mchoro 5, A na B). Katika miundo hii miwili, CDL iko karibu upande wa saitoplazimu wa tata, huku POPC, POPG na β-DDM zikiwa nyingi upande wa mwanga. Molekuli mbili za lipidi na sabuni zilitengwa katika eneo la αβ-1 hadi αβ-6 la tata ya RC-LH114-W (Mchoro 5A), na tano zilitengwa katika eneo sawa la RC-LH116 (Mchoro 5B). Lipidi zaidi zilipatikana upande wa pili wa tata, hasa CDL, zilizokusanywa kati ya RC na αβ-7 hadi αβ-13 (Mchoro 5, A na B). Lipidi na sabuni zingine zilizotatuliwa kimuundo ziko nje ya pete ya LH1, na minyororo ya asili iliyotatuliwa vizuri hupanuka kati ya vitengo vidogo vya LH1, ambavyo kwa kawaida huteuliwa kama β-DDM katika RC-LH114-W, na hufafanuliwa kama β-DDM katika mchanganyiko wa RC A wa β-DDM na POPC-LH116. Nafasi zinazofanana za lipidi na sabuni za chelating katika muundo wetu zinaonyesha kuwa ni maeneo muhimu ya kufungamana kisaikolojia (Mchoro S12A). Nafasi za molekuli sawa katika Tch pia zina uthabiti mzuri. Laini na Trv. Mchuzi 970 RC-LH1s (Mchoro S12, B hadi E) (9, 12) na mabaki ya hidrojeni-bonding ya kundi la kichwa cha lipidi yalionyesha uhifadhi mzuri katika mpangilio wa mfuatano (Mchoro S13), ikionyesha kwamba CDL iliyohifadhiwa ambayo hufungamana na RC (24), maeneo haya yanaweza kuhifadhiwa katika mchanganyiko wa RC-LH1.
(A na B) Peptidi za RC-LH114-W (A) na RC-LH116 (B) zinawakilishwa na katuni, na rangi zinawakilishwa na vijiti, kwa kutumia mpango wa rangi katika Mchoro 1. Lipidi zinaonyeshwa kwa rangi nyekundu, na sabuni zinaonyeshwa kwa rangi ya kijivu. UQ iliyounganishwa na maeneo ya RC QA na QB ni ya manjano, huku UQ iliyotengwa ni ya bluu. (C na D) Mitazamo sawa na (A) na (B), huku lipidi zikiondolewa. (E hadi G) Mtazamo uliopanuliwa wa Q1(E), Q2(F) na Q3(G) kutoka RC-LH116, ikiwa na minyororo ya pembeni inayoathiriana. Vifungo vya hidrojeni vinaonyeshwa kama mistari nyeusi yenye mistari.
Katika RC-LH116, RC QA na QB UQ zote mbili, ambazo hushiriki katika uhamishaji wa elektroni katika mchakato wa utenganishaji wa chaji, hutengana katika maeneo yao ya kufungamana. Hata hivyo, katika RC-LH114-W, quinone ya QB haijatatuliwa na itajadiliwa kwa undani hapa chini. Mbali na quinone za QA na QB, molekuli mbili za UQ zilizochemshwa (zilizoko kati ya pete za RC na LH1) zimetengwa katika muundo wa RC-LH114-W kulingana na nafasi ya vichwa vyao vilivyochemshwa vizuri (zilizoko katika Q1 na Q2, mtawalia). Mchoro 5C). Vitengo viwili vya isoprene vimepewa Q1, na ramani ya msongamano hutatua mikia 10 kamili ya isoprene ya Q2. Katika muundo wa RC-LH16, molekuli tatu za UQ10 zilizochemshwa (Q1 hadi Q3, Mchoro 5D) zilitatuliwa, na molekuli zote zina msongamano wazi katika mkia wote (Mchoro 5, D hadi G). Katika miundo hiyo miwili, nafasi za vikundi vya kichwa cha quinone vya Q1 na Q2 zina uthabiti bora (Mchoro S12F), na huingiliana tu na RC. Q1 iko kwenye mlango wa pengo la W la RC-LH114-W (Mchoro 1G na 5, C, D na E), na Q2 iko karibu na eneo la kufungamana la QB (Mchoro 5, C, D) na F). Mabaki ya L-Trp143 na L-Trp269 yaliyohifadhiwa yako karibu sana na Q1 na Q2 na hutoa mwingiliano unaowezekana wa π-stacking (Mchoro 5, E na F, na Mchoro S12). L-Gln88, 3.0 Å kutoka kwa oksijeni ya mbali ya Q1, hutoa dhamana kali ya hidrojeni (Mchoro 5E); mabaki haya yamehifadhiwa katika RC zote isipokuwa uhusiano wa mbali zaidi (Mchoro S13). L-Ser91 imebadilishwa kihafidhina na Thr katika RC zingine nyingi (Mchoro S13), ni Angstroms 3.8 kutoka kwa oksijeni ya methili ya Q1, na inaweza kutoa vifungo dhaifu vya hidrojeni (Mchoro 5E). Q3 haionekani kuwa na mwingiliano maalum, lakini iko katika eneo la hidrofobi kati ya kitengo kidogo cha RC-M na kitengo kidogo cha LH1-α 5 hadi 6 (Mchoro 5, D na G). Q1, Q2 na Q3 au quinone zilizo karibu zilizo na chelate pia zimetatuliwa katika Tch. Gentle, Trv. Strain 970 na Blc. Muundo wa iris (9, 10, 12) unaelekeza kwenye eneo la kumfunga quinone msaidizi lililohifadhiwa katika tata ya RC-LH1 (Mchoro S12G). UQ tano zilizooza katika RC-LH116 zinakubaliana vyema na 5.8±0.7 ya kila mchanganyiko unaoamuliwa na kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa juu (HPLC), huku UQ tatu zilizooza katika RC-LH114-W zikiwa chini kuliko Thamani iliyopimwa ya 6.2±0.3 (Mchoro S14) inaonyesha kuwa kuna molekuli za UQ ambazo hazijatatuliwa katika muundo.
Polipoptidi za L na M zisizo na ulinganifu kila moja ina TMH tano na huunda heterodimer inayochanganya dimer moja ya BChl, monoma mbili za BChl, monoma mbili za bakteriofaji (BPh), na chuma kimoja kisicho cha Heme na molekuli moja au mbili za UQ10. Kupitia uwepo wa vifungo vya hidrojeni kwenye kundi la ketoni la mwisho na mkusanyiko wake unaojulikana katika Rps, karotenoidi hujumuishwa katika subuniti ya M, ambayo huitwa cis-3,4-dehydroorhodopin. Spishi (25). Eneo la nje la utando wa RC-H limeunganishwa kwenye utando na TMH moja. Muundo wa jumla wa RC ni sawa na subuniti tatu za RC za spishi zinazohusiana (kama vile Rba). sphaeroides (ID ya PDB: 3I4D). Mizunguko mikubwa ya BChl na BPh, uti wa mgongo wa carotenoidi na chuma kisicho cha heme huingiliana ndani ya safu ya azimio la miundo hii, kama vile kundi la kichwa cha UQ10 kwenye tovuti ya QA na kwinoni ya QB kwenye RC-LH116 (Mchoro S15).
Upatikanaji wa miundo miwili ya RC yenye viwango tofauti vya umiliki wa eneo la QB hutoa fursa mpya ya kuchunguza mabadiliko thabiti ya umbo yanayoambatana na kufungamana kwa quinone ya QB. Katika mchanganyiko wa RC-LH116, quinone ya QB iko katika nafasi ya "karibu" iliyofungwa kikamilifu (26), lakini utenganisho wa RC-LH114-W hauna quinone ya QB. Hakuna quinone ya QB katika RC-LH114-W, jambo ambalo linashangaza kwa sababu mchanganyiko huo unafanya kazi, zaidi ya mchanganyiko wa RC-LH116 wenye quinone ya QB iliyosuluhishwa kimuundo. Ingawa pete mbili za LH1 zina chembe za quinone sita, tano zimesuluhishwa kimuundo katika pete ya RC-LH116 iliyofungwa, huku tatu pekee zikiwa na kikomo kimuundo katika pete ya wazi ya RC-LH114-W. Ugonjwa huu ulioongezeka wa kimuundo unaweza kuonyesha uingizwaji wa haraka wa maeneo ya QB ya RC-LH114-W, kinetiki ya haraka ya quinone katika mchanganyiko, na uwezekano ulioongezeka wa kuvuka kitanzi cha LH1. Tunapendekeza kwamba ukosefu wa UQ katika eneo la RC QB la RC-LH114-W unaweza kuwa matokeo ya tata tata na inayofanya kazi zaidi, na eneo la QB la RC-LH114-W limegandishwa mara moja katika mzunguko wa UQ. Hatua maalum (mlango wa kuingia kwenye eneo la QB umefungwa) inaonyesha muundo wa shughuli hii.
Bila QB, mzunguko unaoambatana wa L-Phe217 hadi nafasi ambayo haiendani na uunganishaji wa UQ10, kwa sababu itasababisha mgongano wa anga na kitengo cha kwanza cha isoprene cha mkia (Mchoro 6A). Kwa kuongezea, mabadiliko kuu ya dhahiri ya umbo ni dhahiri, haswa helix de (helix fupi katika kitanzi kati ya TMH D na E) ambapo L-Phe217 huhamishiwa kwenye mfuko wa uunganishaji wa QB na mzunguko wa L-Tyr223 (Mchoro 6A) Ili kuvunja dhamana ya hidrojeni na mfumo wa M-Asp45 na kufunga mlango wa tovuti ya uunganishaji wa QB (Mchoro 6B). Helix de huzunguka kwenye msingi wake, Cα ya L-Ser209 huhamishiwa kwa 0.33Å, huku L-Val221Cα ikihamishiwa kwa 3.52Å. Hakuna mabadiliko yanayoonekana katika TMH D na E, ambayo yanaweza kuzidi katika miundo yote miwili (Mchoro 6A). Kwa kadiri tunavyojua, huu ndio muundo wa kwanza katika RC asilia unaofunga eneo la QB. Ulinganisho na muundo kamili (uliofungwa na QB) unaonyesha kwamba kabla ya quinone kupunguzwa, mabadiliko ya umbo yanahitajika ili kuifanya iingie kwenye quinone. L-Phe217 huzunguka ili kuunda mwingiliano wa π-stacking na kundi la kichwa cha quinone, na helix husogea nje, ikiruhusu mifupa ya L-Gly222 na mnyororo wa kando wa L-Tyr223 kuunda mtandao wa dhamana ya hidrojeni wenye muundo thabiti wa dhamana ya hidrojeni (Mchoro 6, A na C).
(A) Katuni inayoingiliana ya hologramu (mnyororo wa L, mnyororo wa chungwa/M, magenta) na muundo wa apo (kijivu), ambapo mabaki muhimu yanaonyeshwa katika umbo la uwakilishi unaofanana na fimbo. UQ10 inawakilishwa na upau wa manjano. Mstari ulio na nukta unaonyesha vifungo vya hidrojeni vilivyoundwa katika muundo mzima. (B na C) Uwakilishi wa uso wa apolipoprotein na muundo mzima wa pete, ukionyesha oksijeni ya mnyororo wa pembeni wa L-Phe217 katika bluu na L-Tyr223 katika nyekundu, mtawalia. Kitengo kidogo cha L ni chungwa; vitengo vidogo vya M na H havijapakwa rangi. (D na E) Apolipoprotein (D) na maeneo yote ya RC QB [rangi kwa (A) mtawalia] na Thermophilus thermophilus PSII (kijani, bluu na kwinoni ya plastiki; Kitambulisho cha PDB: 3WU2) Pangilia (58).
Kwa ghafla, ingawa miundo kadhaa ya RC zenye upungufu wa QB bila LH1 zinapatikana, mabadiliko ya umbo yaliyoonekana katika utafiti huu hayajaripotiwa hapo awali. Hizi ni pamoja na muundo wa kupungua kwa QB kutoka Blc. viridis (ID ya PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID ya PDB: 1EYS) (28) na Rba. sphaeroides (ID ya PDB: 1OGV) (29), ambazo zote ni sawa na muundo wao wa jumla wa QB. Ukaguzi wa karibu wa 3PRC ulionyesha kuwa molekuli za sabuni za LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) hufunga kwenye mlango wa nafasi ya QB, ambayo inaweza kuzuia kupanga upya katika umbo lililofungwa. Ingawa LDAO haiozi katika nafasi sawa katika 1EYS au 1OGV, RC hizi huandaliwa kwa kutumia sabuni sawa na kwa hivyo zinaweza kutoa athari sawa. Muundo wa fuwele wa Rba. Sphaeroides RC iliyounganishwa kwa saitokromu c2 (Kitambulisho cha PDB: 1L9B) pia inaonekana kuwa na eneo la QB lililofungwa. Hata hivyo, katika hali hii, eneo la N-terminal la polipeptidi ya RC-M (linaloingiliana na eneo la kufungamana la QB kupitia kifungo cha H cha mabaki ya Tyr kwenye heliksi ya Q) linachukua umbo lisilo la kawaida, na mabadiliko ya umbo la QB hayajachunguzwa zaidi (30). Kinachotia moyo ni kwamba hatujaona aina hii ya umbo la polipeptidi ya M katika muundo wa RC-LH114-W, ambao ni sawa na eneo la N-terminal la RC-LH116 RC. Ikumbukwe pia kwamba baada ya kutokomeza antena ya LH1 inayotokana na sabuni, RC za apolipoprotein katika PDB zilitatuliwa, ambazo ziliondoa mabwawa ya ndani ya quinone na lipidi katika pengo kati ya RC na uso wa ndani wa pete ya LH1 inayozunguka (31, 32). RC inabaki kufanya kazi kwa sababu inahifadhi viambato vyote, isipokuwa kwa kwinoni ya QB inayoweza kuoza, ambayo si thabiti sana na mara nyingi hupotea wakati wa mchakato wa maandalizi (33). Kwa kuongezea, inajulikana kuwa kuondolewa kwa LH1 na lipidi asilia za mzunguko kutoka kwa RC kunaweza kuwa na athari kwenye utendaji kazi, kama vile muda mfupi wa maisha wa hali ya P+QB iliyotenganishwa na chaji (31, 34, 35). Kwa hivyo, tunadhania kwamba uwepo wa pete ya LH1 ya ndani inayozunguka RC inaweza kudumisha eneo la QB "lililofungwa", na hivyo kuhifadhi mazingira ya ndani karibu na QB.
Ingawa apolipoproteini (bila quinone ya QB) na muundo kamili vinawakilisha picha mbili tu za mabadiliko ya eneo la QB, badala ya mfululizo wa matukio, kuna dalili kwamba kufungamana kunaweza kufungwa ili kuzuia kufungamana tena na hidrokwinoni Ili kuzuia kizuizi cha substrate. Mwingiliano wa quinolol na quinone karibu na eneo la QB la apolipoproteini unaweza kuwa tofauti, jambo linalosababisha kukataliwa kwake na RC. Imependekezwa kwa muda mrefu kwamba mabadiliko ya umbo yana jukumu katika kufungamana na kupungua kwa quinoni. Uwezo wa RC zilizogandishwa kupunguza quinoni baada ya kubadilika kwa giza kuharibika (36); crystallografia ya X-ray inaonyesha kwamba uharibifu huu unatokana na quinoni za QB kukwama katika umbo la "distal" takriban 4.5 Å kutoka nafasi ya karibu inayofanya kazi (26), 37). Tunapendekeza kwamba umbo hili la kufungamana la distal ni picha ya hali ya kati kati ya apolipoproteini na muundo kamili wa pete, ambayo hufuata mwingiliano wa awali na quinone na ufunguzi wa eneo la QB.
Aina ya II RC inayopatikana katika mchanganyiko wa PSII wa bakteria fulani wa mwanga na sianobacteria, mwani na mimea ina uhifadhi wa kimuundo na utendaji kazi (38). Mpangilio wa kimuundo unaoonyeshwa kwenye Mchoro 6 (D na E) unasisitiza kufanana kati ya PSII RCs na eneo la QB la mchanganyiko wa bakteria wa RC. Ulinganisho huu umekuwa kielelezo cha kusoma mifumo inayohusiana kwa karibu ya kufunga na kupunguza kwa kwinoni. Machapisho ya awali yalipendekeza kwamba mabadiliko ya umbo yanaambatana na upunguzaji wa PSII wa kwinoni (39, 40). Kwa hivyo, kwa kuzingatia uhifadhi wa mageuko wa RC, utaratibu huu wa kufunga ambao haukuonekana hapo awali unaweza pia kutumika kwa eneo la QB la PSII RC katika mimea ya mwanga yenye oksijeni.
Rps ΔpufW (kufutwa kwa pufW bila lebo) na PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W iliyoonyeshwa kutoka kwa aina asilia za pufW locus). CGA009 ya palustris ilielezewa katika kazi yetu ya awali (16). Aina hizi na mzazi wa aina ya mwitu wa isogenic zilipatikana kutoka kwenye friji kwa kusambaza idadi ndogo ya seli kwenye PYE (kila lita 5 g -1) (iliyohifadhiwa katika LB kwa -80 °C, ikiwa na protini ya 50% (w/v) glycerol), dondoo la chachu na agar ya succinate [1.5% (w/v)]. Sahani iliwekwa kwenye incubation usiku kucha gizani kwenye joto la kawaida chini ya hali ya anaerobic, na kisha kuangazwa na mwanga mweupe (~50 μmolm-2 s-1) uliotolewa na balbu za halojeni za OSRAM 116-W (RS Components, UK) kwa siku 3 hadi 5 hadi koloni moja itakapoonekana. Koloni moja ilitumika kuchanja mililita 10 za kati ya M22+ (41) zilizoongezewa asidi ya kasamino ya 0.1% (w/v) (hapa itajulikana kama M22). Utamaduni ulikuzwa chini ya hali ya chini ya oksijeni gizani kwa nyuzi joto 34 na kutikiswa kwa kasi ya 180 rpm kwa saa 48, na kisha mililita 70 za utamaduni zilichanjwa chini ya hali hiyo hiyo kwa saa 24. Utamaduni wa nusu-aerobic wenye ujazo wa mililita 1 hutumika kuchanja mililita 30 za utamaduni wa M22 katika chupa ya glasi ya uwazi ya skrubu ya mililita 30 na kuchomwa na msisimko (~50μmolm-2 s-1) kwa saa 48 kwa nguvu ya sumaku tasa. Kijiti cha kuchochea. Kisha mililita 30 za utamaduni zilichanjwa kwa takriban lita 1 ya utamaduni chini ya hali hiyo hiyo, ambayo kisha ilitumika kuchanja takriban lita 9 za utamaduni zilizowashwa kwa ~200 μmolm-2 s-1 kwa saa 72. Seli zilivunwa kwa kutumia centrifugation kwenye 7132 RCF kwa dakika 30, zikasimamishwa tena katika ~10 ml ya 20 mM tris-HCl (pH 8.0), na kuhifadhiwa kwa -20°C hadi itakapohitajika.
Baada ya kuyeyuka, ongeza fuwele za deoksiribonuklease I (Merck, Uingereza), lysozyme (Merck, Uingereza) na vidonge viwili vya Roche holoenzyme protease inhibitors (Merck, Uingereza) kwenye seli zilizosimamishwa tena. Katika seli ya shinikizo la Kifaransa ya psi 20,000 (Aminco, Marekani), seli zilivurugika mara 8 hadi 12. Baada ya kuondoa seli ambazo hazijavunjika na uchafu usioyeyuka kwa kusukuma kwa nguvu kwenye 18,500 RCF kwa dakika 15 kwa 4°C, utando ulisukumwa kutoka kwa lysate iliyopakwa rangi kwa kusukuma kwa nguvu kwenye 113,000 RCF kwa saa 2 kwa 43,000°C. Tupa sehemu inayoyeyuka na usimamishe tena utando wenye rangi kwenye 100 hadi 200 ml ya 20 mM tris-HCl (pH 8.0) na ubadilishe kuwa homogeneous hadi hakuna mkusanyiko unaoonekana. Utando ulioning'inizwa uliwekwa kwenye 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, Marekani) yenye 2% (w/v) β-DDM kwa saa 1 gizani kwenye 4°C huku ukikoroga kwa upole. Kisha tumia centrifuge kwenye 70°C ili kuyeyusha RCF 150,000 kwenye 4°C kwa saa 1 ili kuondoa mabaki yasiyoyeyuka.
Utando unaoyeyuka kutoka kwa aina ya ΔpufW ulitumika kwenye safu wima ya kubadilishana ioni za DEAE Sepharose ya 50 ml yenye ujazo wa safu wima tatu (CV) za bafa ya kufunga [20 mM tris-HCl (pH 8.0) iliyo na 0.03% (w / v) β-DDM]. Osha safu wima kwa kutumia bafa mbili za kufunga CV, kisha osha safu wima kwa kutumia bafa mbili za kufunga zenye NaCl 50 mM. Mchanganyiko wa RC-LH116 uliondolewa kwa mpangilio wa mstari wa NaCl 150 hadi 300 mM (katika bafa ya kufunga) kwenye 1.75 CV, na mchanganyiko uliobaki wa kufunga uliondolewa kwa kutumia bafa ya kufunga yenye NaCl 300 mM kwenye 0.5 CV. Kusanya wigo wa unyonyaji kati ya nm 250 na 1000, weka sehemu yenye uwiano wa unyonyaji (A880/A280) zaidi ya 1 kwenye nm 880 hadi 280, punguza mara mbili kwenye bafa ya kufungamana, na utumie utaratibu uleule tena kwenye safu wima ya DEAE On purification. Punguza sehemu zenye uwiano wa A880/A280 zaidi ya uwiano wa 1.7 na A880/A805 zaidi ya 3.0, fanya raundi ya tatu ya ubadilishanaji wa ioni, na uhifadhi sehemu zenye uwiano wa A880/A280 zaidi ya uwiano wa 2.2 na A880/A805 zaidi ya 5.0. Mchanganyiko uliosafishwa kwa sehemu ulijilimbikizia hadi ~2 ml katika kichujio cha centrifugal cha Amicon 100,000 (MWCO) (Merck, Uingereza), na kupakiwa kwenye safu wima ya kutengwa ya ukubwa wa Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) iliyo na bafa ya NaCl ya 200 mM, na kisha ikaondolewa kwenye bafa hiyo hiyo kwenye 1.5 CV. Kusanya spektra ya unyonyaji ya sehemu ya kutengwa ya ukubwa, na zingatia spektra ya kunyonya kwa uwiano wa A880/A280 zaidi ya uwiano wa 2.4 na A880/A805 zaidi ya uwiano wa 5.8 hadi 100 A880, na utumie mara moja kwa ajili ya maandalizi au uhifadhi wa gridi ya cryo-TEM. Weka kwenye -80°C hadi itakapohitajika.
Utando unaoyeyuka kutoka kwa aina ya PufW-His uliwekwa kwenye safu wima ya HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ya mililita 20 (20 mM tris-HCl (pH 8.0) iliyo na 200 mM NaCl na 0.03% (w/w)) katika bafa ya IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Safu wima ilioshwa na CV tano za bafa ya IMAC, na kisha na CV tano za bafa ya IMAC iliyo na histidine ya mM 10. Kiini cha mchanganyiko kiliondolewa kutoka kwenye safu wima kwa kutumia bafa tano za IMAC zilizo na histidine ya mM 100. Sehemu iliyo na tata ya RC-LH114-W imejilimbikizia hadi ~10 ml kwenye tanki lililochanganywa lenye kichujio cha Amicon 100,000 MWCO (Merck, Uingereza), iliyopunguzwa mara 20 kwa bafa ya kufunga, na kisha kuongezwa hadi 25 ml. Katika safu wima ya DEAE Sepharose, CV nne zilizofungwa kwenye bafa hutumiwa mapema. Osha safu wima kwa kutumia vizuizi vinne vya kuunganisha CV, kisha ondoa mchanganyiko kwenye CV nane kwenye mteremko wa mstari wa 0 hadi 100 mM NaCl (katika kizuizi cha kuunganisha), na CV nne zilizobaki zenye kizuizi cha kuunganisha cha 100 mM. Vizuizi vilivyobaki vilivyoondolewa kwenye kloridi ya sodiamu pamoja na uwiano wa A880/A280 ulio juu kuliko 2.4 na uwiano wa A880/A805 ulio juu kuliko sehemu 4.6 vilijilimbikizia hadi ~2 ml kwenye kichujio cha sentrifugal cha Amicon 100,000 MWCO, na kujazwa na 1.5 CV IMAC mapema. Safu wima ya kutengwa ya Superdex 200 16/600 iliyosawazishwa na Buffer, na kisha ondoa kwenye kizuizi sawa juu ya 1.5 CV. Kusanya spektra za unyonyaji za vipande vya utenganishaji wa ukubwa na uzingatia spektra za unyonyaji kwa uwiano wa A880/A280 zaidi ya uwiano wa 2.1 na A880/A805 zaidi ya uwiano wa 4.6 hadi 100 A880, ambazo hutumika mara moja kwa ajili ya maandalizi ya gridi ya TEM iliyogandishwa au kuhifadhiwa kwa -80°C hadi itakapohitajika.
Friji ya kuzamisha ya Leica EM GP ilitumika kuandaa gridi za TEM zenye joto la chini. Mchanganyiko huo ulipunguzwa kwenye bafa ya IMAC hadi A880 ya 50, na kisha 5μl ilipakiwa kwenye wavu mpya wa shaba wa QUANTIFOIL 1.2/1.3 uliopakwa kaboni (Agar Scientific, UK). Weka gridi kwenye 20°C na unyevunyevu wa jamaa wa 60% kwa sekunde 30, kisha ikauke kwa sekunde 3, na kisha uizime kwenye ethane ya kioevu kwenye -176°C.
Data ya RC-LH114-W ilirekodiwa kwenye eBIC (Kituo cha Upigaji Picha cha Kielektroniki) (Chanzo cha Mwanga cha Almasi ya Uingereza) kwa kutumia darubini ya Titan Krios, ambayo inafanya kazi kwa volteji ya kuongeza kasi ya 300kV, ikiwa na ukuzaji wa kawaida wa 130,000× na nishati ya- Chagua pengo la 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum yenye kigunduzi cha kilele cha K2 ilitumika kurekodi picha katika hali ya kuhesabu ili kukusanya data. Ukubwa wa pikseli uliorekebishwa ni 1.048Å, na kiwango cha kipimo ni 3.83 e-Å-2s-1. Nilikusanya filamu kwa sekunde 11 na kuigawanya katika sehemu 40. Tumia eneo lililofunikwa na kaboni kulenga upya darubini, na kisha kukusanya filamu tatu kwa kila shimo. Kwa jumla, filamu 3130 zilikusanywa, zikiwa na thamani za defocus kati ya -1 na -3μm.
Data ya RC-LH116 ilikusanywa kwa kutumia darubini ile ile katika Maabara ya Biostructure ya Asterbury (Chuo Kikuu cha Leeds, Uingereza). Data ilikusanywa katika hali ya kuhesabu kwa kuongeza ukubwa wa 130 k, na ukubwa wa pikseli ulirekebishwa hadi 1.065 Å kwa kipimo cha 4.6 e-Å-2s-1. Filamu ilirekodiwa kwa sekunde 12 na kugawanywa katika sehemu 48. Kwa jumla, filamu 3359 zilikusanywa, zikiwa na thamani za defocus kati ya -1 na -3μm.
Usindikaji wote wa data unafanywa katika bomba la Relion 3.0 (42). Tumia Motioncorr 2 (43) kurekebisha mwendo wa boriti kwa kupima kipimo, na kisha utumie CTFFIND 4.1 (44) kubaini kigezo cha CTF (kitendakazi cha uhamishaji tofauti). Mikrografu za kawaida za picha baada ya hatua hizi za awali za usindikaji zinaonyeshwa kwenye Mchoro 2. S16. Kiolezo cha uteuzi otomatiki huzalishwa kwa kuchagua kwa mikono takriban pikseli 250 za chembe 1000 katika fremu ya pikseli 250 na uainishaji usio na marejeleo wa pande mbili (2D), na hivyo kukataa uainishaji huo unaokidhi uchafuzi wa sampuli au usio na sifa zinazoonekana. Kisha, uteuzi otomatiki ulifanywa kwenye mikrofotografi zote, na RC-LH114-W ilikuwa chembe 849,359, na tata ya RC-LH116 ilikuwa chembe 476,547. Chembe zote zilizochaguliwa zimepitia raundi mbili za uainishaji wa 2D usio wa marejeleo, na baada ya kila mbio, chembe zinazokidhi eneo la kaboni, uchafuzi wa sampuli, hakuna vipengele dhahiri au chembe zinazoingiliana kwa nguvu hukataliwa, na kusababisha chembe 772,033 (90.9%) na 359,678 (75.5%) hutumika kwa uainishaji wa 3D wa RC-LH114-W na RC-LH116 mtawalia. Mfano wa awali wa marejeleo wa 3D ulitengenezwa kwa kutumia mbinu ya kushuka kwa gradient ya stochastic. Kwa kutumia mfano wa awali kama marejeleo, chembe zilizochaguliwa zimeainishwa katika kategoria nne katika 3D. Kwa kutumia mfano katika kategoria hii kama marejeleo, fanya uboreshaji wa 3D kwenye chembe katika kategoria kubwa zaidi, kisha tumia kichujio cha awali cha 15Å cha kupita chini ili kufunika eneo la kutengenezea, ongeza pikseli 6 za kingo laini, na baada ya kusindika pikseli ili kurekebisha kitendakazi cha uhamishaji wa kilele cha Gatan K2 cha kigunduzi cha juu. Kwa seti ya data ya RC-LH114-W, modeli hii ya awali ilibadilishwa kwa kuondoa msongamano mkali kwenye kingo za barakoa (imetenganishwa na msongamano tata wa kiini katika UCSF Chimera). Mifumo inayotokana (maazimio ya RC-LH114-W na RC-LH116 ni 3.91 na 4.16 Å, mtawalia) hutumika kama marejeleo ya raundi ya pili ya uainishaji wa 3D. Chembe zinazotumika zimepangwa katika darasa la awali la 3D na hazina uhusiano mkubwa na ujirani. Zinaingiliana au ukosefu wa vipengele dhahiri vya kimuundo. Baada ya raundi ya pili ya uainishaji wa 3D, kategoria yenye azimio la juu zaidi ilichaguliwa [Kwa RC-LH114-W, kategoria moja ni chembe 377,703 (44.5%), kwa RC-LH116, kuna kategoria mbili, jumla ya chembe 260,752 (54.7%), Ambapo zinafanana tu zinapopangwa baada ya mzunguko wa awali na tofauti ndogo]. Chembe zilizochaguliwa hutolewa tena kwenye kisanduku cha pikseli 400 na kusafishwa kwa njia ya uboreshaji wa 3D. Barakoa ya kutengenezea huzalishwa kwa kutumia kichujio cha awali cha kupitisha chini cha 15Å, upanuzi wa ramani ya pikseli 3 na barakoa laini ya pikseli 3. Kwa kutumia uboreshaji wa CTF kwa kila chembe, urekebishaji wa mwendo wa chembe na raundi ya pili ya uboreshaji wa CTF kwa kila chembe, uboreshaji wa 3D, ufunikaji wa kutengenezea na usindikaji baada ya kila hatua hufanywa baada ya kila hatua ili kuboresha zaidi umbile linalotokana. Kwa kutumia thamani ya kukatwa ya FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) ya 0.143, maazimio ya mifano ya mwisho ya RC-LH114-W na RC-LH116 ni 2.65 na 2.80Å, mtawalia. Mkunjo wa FSC wa modeli ya mwisho unaonyeshwa kwenye Mchoro 2. S17.
Mfuatano wote wa protini hupakuliwa kutoka UniProtKB: LH1-β (PufB; Kitambulisho cha UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; Kitambulisho cha UniProt: O83005); RC-M (PufM; Kitambulisho cha UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; Kitambulisho cha UniProt: A0A4Z9); Protini-W (PufW; Kitambulisho cha UniProt: Q6N1K3). MFANO WA USWISI (45) ulitumika kujenga modeli ya homolojia ya RC, ambayo ina mfuatano wa protini wa RC-L, RC-M na RC-H na muundo wa fuwele wa Rba. sphaeroides RC ilitumika kama kiolezo (Kitambulisho cha PDB: 5LSE) (46). Tumia zana ya "kutoshea ramani" katika UCSF Chimera ili kutoshea modeli iliyozalishwa kwenye ramani (47), kuboresha muundo wa protini, na kitendakazi [4×BChl a (jina la mabaki ya maktaba ya monoma = BCL), 2×BPh a (BPH), aina moja au mbili za UQ10 (U10), chuma kimoja kisicho na heme (Fe) na 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] tumia Coot (48) kuongeza. Kwa kuwa QAK haipatikani kwenye maktaba ya monoma, iliwekwa vigezo kwa kutumia zana ya eLBOW katika PHENIX (49).
Kisha, kitengo kidogo cha LH1 kilijengwa. Hapo awali, kifaa cha ujenzi otomatiki katika PHENIX (49) kilitumika kujenga kiotomatiki sehemu ya mfuatano wa LH1 kwa kutumia ramani na mfuatano wa protini za LH1-α na LH1-β kama ingizo. Chagua kitengo kidogo cha LH1 kilichokamilika zaidi, kitoe na ukipakie kwenye Coot, ongeza mfuatano uliokosekana ndani yake mwenyewe, na uboreshe muundo mzima mwenyewe kabla ya kuongeza BCls mbili (BCL) na spirilloxanthin (CRT) [kulingana na Rps husika Uzito wa tata ya LH1 na kiwango kinachojulikana cha karotenoidi. Spishi (17)]. Nakili kitengo kidogo kamili cha LH1, na utumie "Zana ya Ramani ya Kuweka Docking" ya UCSF Chimera ili kuegesha katika eneo lisilo la mfano la msongamano wa LH1, na kisha uboreshe katika Coot; rudia mchakato hadi vitengo vyote vidogo vya LH1 viwe vimetengenezwa kwa mfano. Kwa muundo wa RC-LH114-W, kwa kutoa msongamano usiotengwa katika Coot, protini hugawanywa kutoka kwa vipengele vilivyobaki visivyo vya protini katika ramani ya USCF Chimera na kifaa cha Autobuild hutumika kuanzisha modeli ya awali, na vitengo vidogo vilivyobaki (protini-W) Modeling. Katika PHENIX (49). Ongeza mfuatano wowote unaokosekana kwenye modeli inayotokana katika Coot (48), na kisha uboreshe kwa mikono kitengo kizima. Msongamano uliobaki usiotengwa unafaa mchanganyiko wa lipidi (ID ya maktaba ya monoma ya PDB ya CDL = CDL, POPC = 6PL na POPG = PGT), sabuni ya β-DDM (LMT) na molekuli za UQ10 (U10). Tumia uboreshaji wa PHENIX (49) na uboreshaji wa mikono katika Coot (48) ili kukamilisha modeli kamili ya awali hadi takwimu za modeli na ubora wa kuona wa ufaao usiweze kuboreshwa zaidi. Hatimaye, tumia LocScale (50) kunoa ramani ya ndani, na kisha fanya mizunguko mingine kadhaa ya kuiga msongamano usiotengwa na uboreshaji wa kiotomatiki na wa mikono.
Peptidi, vitendanishi na lipidi na kwinoni zingine zilizowekwa ndani ya msongamano wao zinaonyeshwa katika Mchoro 1 na 2. S18 hadi S23. Taarifa za takwimu za modeli ya mwisho zinaonyeshwa katika Jedwali S1.
Isipokuwa kama imebainishwa vinginevyo, spektra za ufyonzaji wa UV/Vis/NIR zilikusanywa kwenye spektrofotomita ya Cary60 (Agilent, Marekani) kwa vipindi vya nm 1 kutoka nm 250 hadi nm 1000 na muda wa ujumuishaji wa s.0.1.
Changanya sampuli kwenye cuvette ya quartz yenye njia ya mm 2 hadi A880 ya 1, na kukusanya wigo wa unyonyaji kati ya nm 400 na 1000. Spektropiki za mviringo za dichroic zilikusanywa kwenye spektropolarimita ya Jasco 810 (Jasco, Japani) kwa vipindi vya nm 1 kati ya nm 400 na 950 kwa kiwango cha kuchanganua cha nm 20 min-1.
Kipimo cha kutoweka kwa molar huamuliwa kwa kuongeza kiwango cha msingi hadi A880 ya takriban 50. Punguza ujazo wa 10μl katika bafa ya kufunga ya 990μl au methanoli, na kukusanya wigo wa unyonyaji mara moja ili kupunguza uharibifu wa BChl. Kiwango cha BChl cha kila sampuli ya methanoli kilihesabiwa kwa kipimo cha kutoweka kwa 771 nm cha 54.8 mM-1 cm-1, na kipimo cha kutoweka kiliamuliwa (51). Gawanya kiwango cha BChl kilichopimwa kwa 32 (RC-LH114-W) au 36 (RC-LH116) ili kubaini kiwango cha tata ya msingi, ambacho kisha hutumika kubaini wigo wa unyonyaji wa sampuli hiyo hiyo iliyokusanywa katika kigezo cha kutoweka cha bafa. sambamba. Vipimo vitatu vilivyorudiwa vilichukuliwa kwa kila sampuli, na wastani wa unyonyaji wa kiwango cha juu cha BChl Qy ulitumika kwa hesabu. Kipimo cha kutoweka cha RC-LH114-W kilichopimwa kwa 878 nm ni 3280±140 mM-1 cm-1, huku kipimo cha kutoweka cha RC-LH116 kilichopimwa kwa 880 nm ni 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 ilipimwa kulingana na mbinu iliyo katika (52). Kwa kifupi, HPLC ya awamu ya nyuma (RP-HPLC) ilifanywa kwa kutumia mfumo wa Agilent 1200 HPLC. Futa takriban 0.02 nmol ya RC-LH116 au RC-LH114-W katika 50μl ya 50:50 methanoli:klorofomu yenye kloridi ya feri ya 0.02% (w/v), na uchome Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm iliyosawazishwa kabla. Futa katika 1 ml-1 min-1 kwa 40°C katika kiyeyusho cha HPLC (80:20 methanoli:2-propanol) kwenye safu wima ya ×25 cm. Fanya uondoaji wa isokratiki katika kiyeyusho cha HPLC ili kufuatilia unyonyaji katika 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoids) na 780 nm (BChl) kwa saa 1. Kilele katika kromatogramu ya 275 nm kwa dakika 25.5 kiliunganishwa, ambacho hakikuwa na misombo mingine yoyote inayoweza kugunduliwa. Eneo lililounganishwa hutumika kuhesabu kiasi cha molar cha UQ10 kilichotolewa kwa kurejelea mkunjo wa urekebishaji uliohesabiwa kutoka kwa sindano ya viwango safi kutoka 0 hadi 5.8 nmol (Mchoro S14). Kila sampuli ilichambuliwa katika nakala tatu, na hitilafu iliyoripotiwa inalingana na SD ya wastani.
Suluhisho lenye mchanganyiko wa RC-LH1 lenye ufyonzaji wa juu wa Qy wa 0.1 lilitayarishwa kwa kutumia saitokromu ya moyo wa farasi iliyopunguzwa ya 30 μM c2 (Merck, Uingereza) na 0 hadi 50 μMUQ2 (Merck, Uingereza). Sampuli tatu za 1-ml zilitayarishwa katika kila mkusanyiko wa UQ2 na kuwekwa kwenye incubation usiku kucha gizani kwa 4°C ili kuhakikisha urekebishaji kamili wa giza kabla ya kipimo. Suluhisho lilipakiwa kwenye spectrophotometer ya moduli ya OLIS RSM1000 iliyo na wavu wa mstari wa mwali/500 nm 300, ingizo la 1.24 mm, mipasuko ya katikati ya 0.12 mm na 0.6 mm. Kichujio cha kupitisha cha 600 nm kinawekwa kwenye mlango wa mirija ya picha ya sampuli na mirija ya kuzidisha picha ya marejeleo ili kuondoa mwanga wa uchochezi. Ufyonzaji ulifuatiliwa kwa 550 nm na muda wa kuunganisha wa spika 0.15. Mwangaza wa msisimko hutolewa kutoka kwa LED ya 880 nm M880F2 (Diode ya Kutoa Mwanga) (Thorlabs Ltd., Uingereza) kupitia kebo ya fiber optic kwa kiwango cha 90% kupitia kidhibiti cha DC2200 (Thorlabs Ltd., Uingereza) na hutolewa kwenye chanzo cha mwanga kwa pembe ya 90° ya. Mwangaza wa kupimia unapingana na kioo ili kurudisha mwanga wowote ambao haukufyonzwa na sampuli hapo awali. Fuatilia unyonyaji sekunde 10 kabla ya mwangaza wa sekunde 50. Kisha unyonyaji ulifuatiliwa zaidi kwa sekunde 60 gizani ili kutathmini kiwango ambacho quinolol hupunguza saitokromu c23 + kwa hiari (tazama Mchoro S8 kwa data ghafi).
Data ilichakatwa kwa kuweka kiwango cha awali cha mstari ndani ya sekunde 0.5 hadi 10 (kulingana na kiwango cha UQ2) na wastani wa viwango vya sampuli zote tatu katika kila kiwango cha UQ2. Kiwango cha RC-LH1 kilichohesabiwa kwa mgawo husika wa kutoweka kilitumika kubadilisha kiwango hicho kuwa ufanisi wa kichocheo, kilichochorwa katika Origin Pro 2019 (OriginLab, Marekani), na kuwekwa kwenye modeli ya Michaelis-Menten ili kubaini thamani dhahiri za Km na Kcat.
Kwa vipimo vya unyonyaji wa muda mfupi, sampuli ya RC-LH1 ilipunguzwa hadi ~2μM katika bafa ya IMAC iliyo na ascorbate ya sodiamu ya 50 mM (Merck, Marekani) na 0.4 mM Terbutin (Merck, Marekani). Asidi ya askobiki hutumika kama mtoaji wa elektroni wa kafara, na tert-butaclofen hutumika kama kizuizi cha QB ili kuhakikisha kwamba mtoaji mkuu wa RC anabaki amepunguzwa (yaani, sio oksidi ya fotoksi) katika mchakato wote wa kipimo. Takriban mililita 3 za sampuli huongezwa kwenye seli inayozunguka maalum (karibu mduara wa mita 0.1, 350 RPM) yenye urefu wa njia ya macho ya milimita 2 ili kuhakikisha kwamba sampuli katika njia ya leza ina muda wa kutosha wa kukabiliana na giza kati ya mapigo ya msisimko. Tumia mapigo ya leza ya ~100-fs ili kuongeza mfumo wa leza ya Ti: Sapphire (Spectra Physics, Marekani) ili kusisimua sampuli kwa 880 nm kwa kiwango cha marudio cha 1 kHz (20 nJ kwa NIR au 100 nJ kwa Vis). Kabla ya kukusanya data, weka sampuli kwenye mwanga wa uchochezi kwa takriban dakika 30. Mfiduo utasababisha kuzima kwa QA (labda kupunguza QA mara moja au mbili). Lakini tafadhali kumbuka kuwa mchakato huu unaweza kubadilishwa kwa sababu baada ya kipindi kirefu cha mabadiliko ya giza, RC itarudi polepole kwenye shughuli ya QA. Spektromita ya Helios (Ultrafast Systems, Marekani) ilitumika kupima spektromita za muda mfupi zenye muda wa kuchelewesha wa -10 hadi 7000 ps​​. Tumia programu ya Surface Xplorer (Ultrafast Systems, Marekani) kutenganisha seti za data, kisha kuunganisha na kusawazisha. Tumia kifurushi cha programu cha CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) kutumia seti ya data iliyojumuishwa ili kupata spektromita tofauti zinazohusiana na kuoza, au tumia kitendakazi kinachohusisha vielekezi vingi na mwitikio wa kifaa ili kuendana na mageuko ya spektrolamu ya urefu mmoja katika Asili (OriginLab, Marekani).
Kama ilivyotajwa hapo juu (53), filamu ya usanisinuru iliyo na mchanganyiko wa LH1 isiyo na antena ya RC na LH2 ya pembeni ilitayarishwa. Utando ulipunguzwa katika tris 20 mM (pH 8.0) na kisha kupakiwa kwenye cuvette ya quartz yenye njia ya macho ya 2 mm. Mpasuko wa leza wa 30nJ ulitumika kusisimua sampuli kwa 540 nm kwa muda wa kuchelewa wa -10 hadi 7000 ps. Chambua seti ya data kama ilivyoelezwa kwa sampuli ya rafiki wa Rps.
Utando ulichujwa kwa kutumia centrifugation kwenye 150,000 RCF kwa saa 2 kwa 4°C, na kisha ufyonzaji wake kwenye 880 nm ulisimamishwa tena katika 20 mM tris-HCl (pH 8.0) na 200 mM NaCl. Futa utando kwa kuchochea polepole katika 2% (w/v) β-DDM kwa saa 1 gizani kwenye 4°C. Sampuli ilipunguzwa katika 100 mM triethylammonium kaboneti (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) hadi mkusanyiko wa protini wa 2.5 mg ml-1 (uchambuzi wa Bio-Rad). Usindikaji zaidi ulifanyika kutoka kwa njia iliyochapishwa hapo awali (54), kuanzia na upunguzaji wa 50 μg protini hadi jumla ya 50 μl TEAB yenye 1% (w/v) sodiamu laurate (Merck, UK). Baada ya sonication kwa sekunde 60, ilipunguzwa kwa kutumia tris 5 mM (2-carboxyethyl)fosfini (Merck, UK) kwa joto la 37°C kwa dakika 30. Kwa alkylation ya S, ingiza sampuli kwenye incubation na 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) na uiongeze kutoka kwa mchanganyiko wa isopropanol wa 200 mM kwa dakika 10 kwenye joto la kawaida. Usagaji wa protini ulifanywa kwa kuongeza 2 μg ya trypsin/endoproteinase Lys-C mchanganyiko (Promega UK) na kuingizwa kwenye incubation kwa joto la 37°C kwa saa 3. Kisafishaji cha laurati kilitolewa kwa kuongeza 50 μl ethyl asetate na 10 μl 10% (v/v) asidi trifluoroacetic ya LC daraja la 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) na kusambaza kwa vortex kwa sekunde 60. Mgawanyiko wa awamu ulikuzwa kwa kutumia centrifugation katika 15,700 RCF kwa dakika 5. Kulingana na itifaki ya mtengenezaji, safu wima ya mzunguko ya C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) ilitumika kufyonza kwa uangalifu na kuondoa chumvi katika awamu ya chini iliyo na peptidi. Baada ya kukauka kwa kutumia centrifugation ya utupu, sampuli iliyeyushwa katika 0.5% TFA na 3% asetonitrile, na 500 ng ilichambuliwa kwa kutumia chromatografia ya nanoflow RP pamoja na spektrometri ya wingi kwa kutumia vigezo vya mfumo vilivyoelezwa hapo awali.
Tumia MaxQuant v.1.5.3.30 (56) kwa utambuzi wa protini na upimaji ili kutafuta hifadhidata ya proteome ya Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data ya proteomics ya spektrometri ya wingi imewekwa katika Muungano wa ProteomeXchange kupitia hazina ya washirika wa PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) chini ya kitambulisho cha seti ya data PXD020402.
Kwa uchambuzi wa RPLC pamoja na electrospray ionization mass spectrometry, RC-LH1 complex ilitayarishwa kutoka kwa aina ya Rps ya porini. Kwa kutumia mbinu iliyochapishwa hapo awali (16), mkusanyiko wa protini uliozalishwa katika seli za palustris ulikuwa 2 mg ml-1 katika 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl na 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM. Kulingana na itifaki ya mtengenezaji, tumia kifaa cha utakaso wa 2D (GE Healthcare, USA) kutoa 10 μg protini kwa njia ya mvua, na kuyeyusha precipitate katika 20 μl 60% (v/v) asidi fomi (FA), 20% (v/v) Acetonitrile na 20% (v/v) maji. Mikrolita tano zilichambuliwa na RPLC (Dionex RSLC) pamoja na spectrometry ya mass (Maxis UHR-TOF, Bruker). Tumia safu wima ya MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) kwa kutenganisha katika 60°C na 100μlmin -1, yenye mteremko wa 85% (v / v) kiyeyusho cha A [0.1% (v / v) FA na 0.02% (V/v) TFA ya maji] hadi kiyeyusho cha 85% (v/v) B [0.1% (v/v) FA na 0.02% (v/v) katika 90% (v/v) asetonitrile TFA] Kwa kutumia chanzo cha kawaida cha ioni ya kunyunyizia umeme na vigezo chaguo-msingi kwa zaidi ya dakika 60, spectromita ya uzito hupata 100 hadi 2750 m/z (uwiano wa wingi-kwa-chaji). Kwa msaada wa lango la rasilimali ya bioinformatics ya ExPASy zana ya FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), unganisha wigo wa wingi na vitengo vidogo vya tata.
Seli zilikuzwa kwa saa 72 chini ya 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), wastani (30μMm-2 s-1) au juu (300μMm-2 s-1). Medium M22 (medium M22 ambapo ammonium sulfate imeachwa na sodium succinate hubadilishwa na sodium acetate) katika chupa ya skrubu ya mililita 100 (23). Katika mizunguko mitano ya sekunde 30, shanga za kioo za mikroni 0.1 zilipigwa shanga kwa uwiano wa ujazo wa 1:1 ili kulainisha seli na kupozwa kwenye barafu kwa dakika 5. Maada isiyoyeyuka, seli ambazo hazijavunjika na shanga za kioo ziliondolewa kwa kuzungusha kwa senti kwenye 16,000 RCF kwa dakika 10 kwenye microcentrifuge ya benchtop. Utando ulitenganishwa katika rotor ya Ti 70.1 yenye RCF 100,000 katika tris-HCl 20 mM (pH 8.0) yenye gradient ya sucrose ya 40/15% (w/w) kwa saa 10.
Kama ilivyoelezwa katika kazi yetu ya awali, ugunduzi wa kinga ya lebo ya His kwenye PufW (16). Kwa kifupi, kiini kilichosafishwa (11.8 nM) au utando ulio na mkusanyiko sawa wa RC (huamuliwa kwa oksidation ikitoa wigo wa tofauti iliyopunguzwa na kulinganisha mzigo kwenye jeli iliyotiwa rangi) katika bafa ya upakiaji ya SDS 2x (Merck, UK) ilipunguzwa mara mbili. Protini zilitenganishwa kwenye jeli ya NuPage ya nakala ya 12% bis-tris (Thermo Fisher Scientific, UK). Jeli ilitiwa rangi ya Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ili kupakia na kuibua kitengo kidogo cha RC-L. Protini kwenye jeli ya pili ilihamishiwa kwenye utando wa polyvinylidene fluoride (PVDF) ulioamilishwa na methanoli (Thermo Fisher Scientific, UK) kwa ajili ya kipimo cha kinga. Utando wa PVDF uliziba katika 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Kati ya 20 na 5% (w / v) maziwa ya unga yaliyopunguzwa mafuta, na kisha kuwekwa kwenye kingamwili ya msingi ya anti-His (katika Dilute kizuia kingamwili [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl na 0.05% (v/v) Kati ya 20] katika 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, Marekani) kwa saa 4. Baada ya kuosha mara 3 kwa dakika 5 kwenye bafa ya kingamwili, utando uliunganishwa na kingamwili ya pili ya anti-panya ya horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, Uingereza) (iliyopunguzwa 1:10,000 kwenye bafa ya kingamwili). Ingiza ili kuruhusu ugunduzi (dakika 5 baada ya kuosha mara 3 kwenye bafa ya kingamwili) kwa kutumia sehemu ya chemiluminescence ya WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) na Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Uingereza).
Kwa kuchora usambazaji wa nguvu ya kila jeli iliyotiwa rangi au njia ya kipimo cha kinga, kuunganisha eneo lililo chini ya kilele na kuhesabu uwiano wa nguvu ya RC-L (jeli iliyotiwa rangi) na Protini-W (kipimo cha kinga mwilini), katika ImageJ (57) Chambua picha. Uwiano huu ulibadilishwa kuwa uwiano wa molari kwa kudhani kwamba uwiano wa RC-L hadi protini-W katika sampuli safi ya RC-LH114-W ulikuwa 1:1 na kurekebisha seti nzima ya data ipasavyo.
Kwa nyenzo za ziada kwa makala haya, tafadhali tazama http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Hii ni makala ya ufikiaji wazi inayosambazwa chini ya masharti ya Leseni ya Creative Commons Attribution. Makala hiyo inaruhusu matumizi, usambazaji, na uzandikishaji usio na vikwazo katika njia yoyote chini ya sharti kwamba kazi ya asili imetajwa ipasavyo.
Kumbuka: Tunakuomba tu utoe anwani yako ya barua pepe ili mtu unayempendekeza kwenye ukurasa ajue kwamba unataka aone barua pepe hiyo na kwamba si barua taka. Hatutarekodi anwani zozote za barua pepe.
Swali hili linatumika kujaribu kama wewe ni mgeni na kuzuia uwasilishaji wa barua taka kiotomatiki.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Muundo wa ubora wa juu wa tata ya mtego wa mwanga 1 katika kituo cha mmenyuko hutoa maarifa mapya kuhusu mienendo ya kwinoni.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Muundo wa ubora wa juu wa tata ya mtego wa mwanga 1 katika kituo cha mmenyuko hutoa maarifa mapya kuhusu mienendo ya kwinoni.
©2021 Chama cha Marekani cha Kuendeleza Sayansi. haki zote zimehifadhiwa. AAAS ni mshirika wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef na COUNTER. SayansiMaendeleo ISSN 2375-2548.